（山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，山東濟南 250103）

測量不確定度是表征合理地賦予被測量值的分散性，與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[1]。它可以表征被測量值的合理范圍，并直接與檢驗結(jié)果的合格判定相關(guān)。完整的測量結(jié)果表示應(yīng)該包括測量不確定度[2]。由于某些檢測方法的性質(zhì)，決定了無法從計量學(xué)和統(tǒng)計學(xué)角度對測量不確定度進行有效而嚴(yán)格的評估，這時至少應(yīng)通過分析方法，列出各主要的不確定度分量，并做出合理的評估[3]。

泛酸是輔酶A（CoA）和?；d體蛋白（ACP）生物合成的重要前體物質(zhì)，參與人體中類固醇、褪黑激素、抗體和亞鐵血紅素的合成[4]，是維持生命正常生理機能的必需小分子有機物，也是嬰幼兒乳粉中重要的營養(yǎng)物質(zhì)。GB 10765-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品》和GB 10767-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)較大嬰兒和幼兒配方食品》中規(guī)定泛酸在嬰幼兒乳粉中的限量分別為96μg/100kJ～478μg/100kJ和大于70μg/100 kJ，即 1 920 μg/100 g～9 560 μg/100 g 和大于 1 400 μg/100 g（以乳粉能量為2 000 kJ/100 g計）。

目前測定泛酸的方法有高效液相法、氣相色譜法和微生物法[5-7]。微生物法測定泛酸含量靈敏度高，是美國公職分析化學(xué)家協(xié)會AOAC要求的官方檢測方法，也是國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法的仲裁法。該方法操作繁雜，且因微生物生長的不確定性強使得影響結(jié)果的因素很多，對檢驗人員的操作和實驗室設(shè)施要求較高。為了保證泛酸測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，本實驗依據(jù)JJF1059.1-2012和GB/Z 22553-2010對泛酸測定過程中影響檢驗結(jié)果的各個分量進行了評估，并給出擴展不確定度，可據(jù)此提高微生物法測定嬰幼兒乳粉中泛酸的精密度和準(zhǔn)確度。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

試樣為在市場上隨機抽取的嬰幼兒乳粉。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，ATCC8014）；乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基；乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基；泛酸測定用培養(yǎng)基（配制見附錄A[8]）；泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品（＞98.8%），德國Dr.Ehrenstorfer公司；Tris緩沖液；去離子水；0.1 mol/L鹽酸溶液；定量濾紙。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204型電子天平：瑞士梅特勒-托利多儀器公司（精度0.1mg）；PHS-3E型酸度計：上海雷磁公司（精度0.01）；SX-300型高壓蒸汽滅菌鍋：日本TOMY公司；315K型高速冷凍離心機：德國Sigma公司（最大轉(zhuǎn)速15 300 r/min）；SHP-250型生化培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司（36℃±0.5℃）；Cary100型紫外-可見分光光度計：美國瓦里安公司（精度0.000 1）。

1.3 樣品處理與試驗方法

1.3.1 試樣處理與稀釋

稱取2.00 g（精確至0.000 1 g）試樣于三角瓶中，加入10 mL Tris緩沖液和少量去離子水，121℃水解15 min后冷卻。用0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.5，轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中用去離子水定容。取少許稀釋樣液，定量濾紙過濾。取5 mL濾液，用去離子水稀釋至160 mL，即為試樣的測試液。

1.3.2 測定

按照GB5413.17-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中泛酸的測定》6.3～6.8進行標(biāo)準(zhǔn)曲線制作、試樣管制作、滅菌、接種、培養(yǎng)、測定。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、結(jié)果計算與分析

以泛酸含量（ng）為橫坐標(biāo)，OD550nm為縱坐標(biāo)，使用專業(yè)繪圖軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并利用軟件讀取測試液中的泛酸含量[9]。數(shù)值取舍方法按照GB5413.17-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中泛酸的測定》6.10進行。

1.5 計算公式

根據(jù)GB 5413.17-2010，測量結(jié)果計算公式為：

式中：X 為試樣中泛酸含量，（μg/100 g）；Cx為有效試樣管中每毫升測試液泛酸含量的總平均值，ng；m為試樣的質(zhì)量，g；f為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

根據(jù)整個試驗過程分析，微生物法進行泛酸含量測定的不確定度主要來自以下方面：測量重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱取及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、試樣稱量、試樣前處理及稀釋、紫外分光光度計測量偏差[10-12]。

2.2 測量不確定度評定

2.2.1 測量重復(fù)性引入的不確定度

重復(fù)測定產(chǎn)生的不確定度屬于A類不確定度[13]，它包含試樣稱量、試樣前處理及稀釋操作、微生物生長差異、使用器具和儀器引入的不確定度。按照GB 5413.17-2010的要求對同一試樣的泛酸進行12次平行測定，結(jié)果見表1。

表1 乳粉重復(fù)測定的結(jié)果及回收率Table 1 Results and recoveries of the repeated measurements

所測結(jié)果X平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（X）采用平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差s（）來表示，則重復(fù)測定引入的不確定度：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

2.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度

根據(jù)泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品說明書所述，其純度p=（100±1.2）%，按B類不確定度評定[13]，區(qū)間的半寬度為0.001 2，視為矩形分布，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的不確定度

用電子天平準(zhǔn)確稱取44.00 mg泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品，所用天平精度為0.1 mg。根據(jù)檢定證書，最大重復(fù)性誤差為0.2 mg，當(dāng)0≤m≤50 g時，示值誤差為0.5 mg。采用矩陣分布，包含因子為按B類不確定度評定，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程使用了容量瓶、吸量管等玻璃器具，而這些玻璃器具的校準(zhǔn)和室溫對液體體積的影響可導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的偏差[14-15]。

根據(jù)最大允許誤差[16]，按均勻分布處理據(jù)此計算不確定度分量：

據(jù)此計算得出的相對不確定度數(shù)值見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制時玻璃量具校準(zhǔn)引入的不確定度Table 2 Uncertainties for measuring glasses’calibration in standard solution preparation

合成玻璃器具校準(zhǔn)引入的不確定度分量：

實驗室溫度變化介于（20±5）℃之間，與玻璃器具20℃的校準(zhǔn)溫度不同。根據(jù)水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，且遠大于玻璃膨脹系數(shù)。假設(shè)溫度變化為矩形分布，其引入的不確定度分量為：

u（VT）=，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，合成實驗室溫度變化引入的玻璃器具相對不確定度分量：

由標(biāo)準(zhǔn)品及其稱量、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度分量合成的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 試樣稱量引入的不確定度

試樣稱取質(zhì)量介于0～50 mg之間，稱取2.013 2 g，即2 013.2 mg試樣引入的相對不確定度計算方法可參照本文2.2.2.2，應(yīng)為：

2.2.4 試樣前處理及稀釋引入的不確定度

2.2.4.1 試樣前處理引入的不確定度

樣品前處理過程中泛酸存在損失，通過試樣添加泛酸計算回收率，12次試樣添加回收率見表1，回收率范圍88.1%～112.4%，平均回收率為r=99.1%，標(biāo)準(zhǔn)偏差S（r）=0.091。標(biāo)準(zhǔn)不確定度采用平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為因此，由試樣前處理過程產(chǎn)生的相對不確定度為2.64×10-2。

2.2.4.2 試樣稀釋過程引入的不確定度

試樣的前處理過程需要進行稀釋操作，期間使用了容量瓶、吸量管、量筒等玻璃器具，而玻璃器具的校準(zhǔn)和室溫對液體體積的影響可導(dǎo)致試樣泛酸含量測定的偏差。根據(jù)2.2.2.3的公式可計算得出玻璃器具校準(zhǔn)引入的相對不確定度，具體數(shù)值見表3。合成試樣稀釋過程中玻璃量具引入的不確定度：

表3 試樣稀釋時玻璃量具校準(zhǔn)引入的不確定度Table 3 Uncertainties for measuring glasses’calibration in sample dilution

參照2.2.2.3的評估，合成實驗室溫度變化造成的玻璃量具不確定度分量：

由試樣前處理及稀釋過程引入的的不確定度分量合成的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.5 紫外-可見分光光度計測量偏差引入的不確定度

根據(jù)檢定證書，紫外-可見分光光度計的透射比示值誤差是0.4%，透射比重復(fù)性是0.0%，測定值一般為對稱分布，則紫外分光光度計測量偏差引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3 合成不確定度的計算

實驗過程中影響檢驗結(jié)果的各個因素引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表4。綜合各分量可得到合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。則嬰幼兒食品和乳粉中泛酸含量測定的不確定度為：

表4 各影響因素分量引入的不確定度Table 4 Uncertainties of all affecting factors

2.4 擴展不確定度評定

擴展不確定度可由合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子（k），在 95%置信水平下，k=2，因此，試樣中泛酸含量測定的相對擴展不確定度為：

由計算得出的嬰幼兒乳粉中泛酸含量為（1 990.1±121.0）μg/100g。

3 結(jié)語

經(jīng)評估，微生物法測定嬰幼兒乳粉中泛酸含量的操作過程中，對檢驗結(jié)果影響最大的是試樣前處理及稀釋，其次是標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和測量重復(fù)性。試樣的稱量、紫外-可見分光光度計測量偏差對試驗結(jié)果的影響較小。整個試驗過程涉及較多玻璃器具的使用，應(yīng)嚴(yán)格移液操作，從而提高檢驗的精密度和準(zhǔn)確度。

整個測定過程以植物乳桿菌作為媒介，每次測定時的細菌培養(yǎng)溫度、菌齡均有細微差異，這些不易估計的影響因素可粗略用基于試驗及最終結(jié)果的重復(fù)性的標(biāo)準(zhǔn)偏差來表征[17-18]。在以微生物為媒介測定化學(xué)成分的方法中，每次測定時微生物生長狀態(tài)的差異，是檢驗人員操作和儀器測量偏差之外的主要誤差來源。

微生物法測定嬰幼兒乳粉中泛酸的結(jié)果為（1 990.1±121.0）μg/100 g，k=2，p=95%。

[1] 中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/Z22553-2010利用重復(fù)性、再現(xiàn)性和正確度的估計值評估測量不確定度的指南[S] .北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010

[2] 全國法制計量管理計量技術(shù)委員會.JJF1059.1-2012測量不確定度評定與表示[S] .北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2012

[3] 中國合格評定國家認可委員會.CNAS-CL07:2011測量不確定度的要求[S] .北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2011

[4] 楊延輝,肖春玲.泛酸的功能和生物合成[J] .生命的化學(xué),2008,28(4):448-452

[5] Andrieux P,Fontannaz P,Kilinc T,Giménez EC.Pantothenic acid(vitamin B5)in fortified foods:comparison of a novel ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method and a microbiological assay[S] .J AOAC Int,2012,95(1):143-8

[6] Kiyoshi Banno,Masayuki Matsuoka,Shingo Horimoto,et al.Simultaneous determination of pantothenic acid and hopantenic acid in biological samples and natural products by gas chromatographymass fragmentography[J] .Journal of Chromatography B:Biomedical Sciences and Applications,1990,525:255-264

[7] JOAN HOWE WALSH,BONITA W.WYSE,R.GAURTH HANSEN.A comparision of microbiological and radioimmunoassay methods for the determination of pantothenic acid in foods[J] .Journal of Food Biochemistry,1980,3(4):175-189

[8] 中華人民共和國衛(wèi)生部.GB5413.17-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中泛酸的測定[S] .北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010

[9] 劉志楠,喻東威,趙源,等.牛奶中泛酸含量測定[J] .食品科學(xué),2012,33(2):178

[10] 霍艷敏,王艷麗,王駿,等.高效液相色譜法測定嬰幼兒乳粉中煙酰胺的不確定度評定[J] .食品科學(xué),2011,32(16):330-333

[11] 李秀珍,劉鳳琴,呂光宇,等.紫外分光光度法測定維生素B12注射液含量的不確定度分析[J] .齊魯藥事,2012,31(2):90-91

[12] 矯筱蔓,龐燕軍,陸軍,等.紫外分光光度法測定維生素A含量的不確定度評估[J] .中國藥師,2011,14(5):737-738

[13] 全國物理化學(xué)計量技術(shù)委員會.JJF1135-2005化學(xué)分析測量不確定度測定[S] .北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2005

[14] 岳娜.常用玻璃量器容量測量結(jié)果的不確定度評定[J] .計量與測試技術(shù),2012,39(7):66-68

[15] 龔劍,占永革.標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋不確定度評定[J] .實驗技術(shù)與管理,2011,28(25):52-54

[16] 全國流量容量計量技術(shù)委員會.JJG196-2006常用玻璃器具檢定規(guī)程[S] .北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2006

[17] 雷質(zhì)文.食品微生物實驗室質(zhì)量管理手冊[M] .北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2006

[18] P Neaves.Accreditation for microbiology laboratories[S] .Ottawa(Canada):1999,19-24