李承范

(延邊大學(xué) 分析測(cè)試中心，吉林 延吉 133002)

裂蹄木層孔菌[Phellinuslinteus(Berk.et Cart.) Teng]屬木層孔菌屬的藥用真菌,又名針裂蹄、裂蹄針層孔菌等,其子實(shí)體多年生，硬木質(zhì)、無(wú)柄，其形狀呈扁半球形至馬蹄形或不規(guī)則形.研究[1-3]表明，裂蹄木層孔菌的主要化學(xué)成分是子實(shí)體、菌絲體以及發(fā)酵液中的胞外多糖，此外還有黃酮及其衍生物、香豆素類(lèi)、甾醇類(lèi)等化合物.裂蹄木層孔菌具有化癥散結(jié)藥、止血止帶、健脾止瀉的作用[4]，在抗腫瘤、降血糖、抗過(guò)敏等方面也有顯著的作用[5].趙子高、回晶和Jesús Fernando Ayala-Zavala等[6-8]分別對(duì)桑黃液體發(fā)酵菌絲體和桑黃子實(shí)體的黃酮含量和抗氧化活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明桑黃液體發(fā)酵菌絲體和桑黃子實(shí)體中的黃酮物質(zhì)具有明顯的抗氧化活性.本文以裂蹄木層孔菌總黃酮提取物為研究對(duì)象，探討該提取物對(duì)DPPH自由基、羥基自由基,以及超氧陰離子自由基的清除作用.

1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

裂蹄木層孔菌購(gòu)于延吉市長(zhǎng)白山特產(chǎn)品經(jīng)營(yíng)部，由吉林省延邊特產(chǎn)研究所鑒定為多孔菌科裂蹄木層孔菌子實(shí)體.將裂蹄木層孔菌子實(shí)體置于烘箱，于60 ℃烘24 h后粉碎過(guò)60目篩，備用.三氯化鐵、過(guò)氧化氫、亞硝酸鈉、鹽酸、鋅粒、硝酸鋁、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、鄰苯三酚、乙醇、甲醇、三氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、環(huán)己烷均為分析純；蘆丁為中國(guó)生物制品檢定所生產(chǎn)；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)由Sigma生產(chǎn).

1.2 主要儀器與設(shè)備

主要儀器有：U-3400型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日立公司)，DFT-50型手提式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(浙江溫嶺石林大機(jī)械有限公司)，SP210S型電子天平(北京賽多利天平有限公司)，SHBⅢ型循環(huán)水式真空抽濾泵(上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司公司)，Q/BKYY31-200型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，RE-52D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海青浦瀘西儀器廠).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 裂蹄木層孔菌總黃酮提取液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.006 1 g裂蹄木層孔菌子實(shí)體干粉，加入20倍體積濃度為70%的乙醇，于80 ℃水浴回流3 h，過(guò)濾，殘?jiān)貜?fù)上述操作一次；合并兩次提取液，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用70%乙醇溶液定容至刻度，備用.

2.2 裂蹄木層孔菌總黃酮含量的測(cè)定

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取蘆丁樣品0.001 0 g(準(zhǔn)確至0.000 1 g)，置50 mL容量瓶中，用適量70%乙醇置水浴上加熱溶解，放冷，再用30%乙醇稀釋至刻度，得濃度為0.2 mg/mL對(duì)照品溶液.

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程的建立 量取0.2 mg/mL對(duì)照品溶液0、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置于25 mL容量瓶中，各加入70%乙醇至10.0 mL，然后加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL搖勻，放置6 min后加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL搖勻，放置6 min后再加入4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，用70%乙醇稀釋至25 mL；放置15 min后，置比色皿中，以試劑空白調(diào)節(jié)零點(diǎn)，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度.以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖1)，得線性回歸方程Y=0.095 3X+0.077 1，R2=0.998 5，線性范圍為0.002～0.040 mg/mL.

圖1 蘆丁對(duì)照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.3加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 取5份裂蹄木層孔菌總黃酮提取液1.0 mL，分別加入一定量的對(duì)照品溶液后按照2.2.2方法測(cè)定總黃酮含量，并計(jì)算其回收率.

2.2.4總黃酮含量的測(cè)定 分別精密量取待測(cè)液1.0 mL，加入9.0 mL的70%乙醇，置于25 mL容量瓶中，其余按照2.2.2方法處理.通過(guò)回歸方程計(jì)算溶液濃度(C),然后再計(jì)算樣品中總黃酮含量：

式中M表示稱(chēng)取的裂蹄木層孔菌粉末的質(zhì)量(g)，C表示待測(cè)液中的黃酮濃度(g/mL).

2.3 總黃酮提取液對(duì)DPPH自由基清除活性的測(cè)定

測(cè)定按照文獻(xiàn)[9-10]中的方法進(jìn)行，并根據(jù)以下公式計(jì)算溶液的抑制率:

式中Ai為樣品吸光度，Ac為DPPH+70%乙醇混合液吸光度，Aj為樣品+70%乙醇混合液吸光度.

2.4 總黃酮提取液對(duì)羥基自由基清除活性的測(cè)定

鄰二氮菲-Fe2+是一種氧化還原指示劑，其呈色變化可反映出溶液中的氧化還原狀態(tài)的變化.通過(guò)Fenton反應(yīng)(H2O2+Fe2+=HO-+·OH+Fe3+)產(chǎn)生的羥基自由基(·OH)可使鄰二氮菲-Fe2+水溶液氧化成鄰二氮菲-Fe3+，從而使鄰二氮菲-Fe2+在536 nm處的最大吸收峰消失，并引起吸光度的變化.利用文獻(xiàn)[11-12]中的方法進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)以下公式計(jì)算羥自由基的清除率：

式中A2為未損傷管吸光度，A1為損傷管吸光度，A0為樣品的吸光度.

2.5 總黃酮提取液對(duì)超氧陰離子自由基清除活性的測(cè)定

式中Ai為樣品吸光度，Aj為空白吸光度.

3 結(jié)果與討論

3.1 裂蹄木層孔菌黃酮提取液中總黃酮含量的測(cè)定

3.1.1加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示.從表1可知，黃酮含量的平均回收率為100.60%，RSD為1.96%，說(shuō)明本文方法可用于裂蹄木層孔菌總黃酮含量的測(cè)定.

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)

3.1.2總黃酮含量的測(cè)定 按照2.2.4的方法測(cè)定裂蹄木層孔菌總黃酮提取液中黃酮含量的結(jié)果如表2所示.文獻(xiàn)[6]中桑黃液體發(fā)酵不同階段菌絲體乙醇提取物中黃酮含量從4.4 mg/g增加到159 mg/g；文獻(xiàn)[7]中用超聲波提取桑黃子實(shí)體黃酮含量為16.14 mg/g；文獻(xiàn)[8]中不同桑黃子實(shí)體中黃酮含量為26.48～30.58 mg/g.表2結(jié)果說(shuō)明裂蹄木層孔菌總黃酮含量高于桑黃中的總黃酮含量.

表2 裂蹄木層孔菌樣品中總黃酮含量

3.2 裂蹄木層孔菌總黃酮的抗氧化性研究

3.2.1對(duì)DPPH自由基的清除活性 裂蹄木層孔菌總黃酮對(duì)DPPH·的清除能力如圖2所示：當(dāng)總黃酮的濃度為76.4 μg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH·的清除率最高，為92.57%；之后，隨著總黃酮濃度的增加，清除率逐步下降.

圖2 不同濃度總黃酮溶液對(duì)DPPH自由基的清除率

3.2.2對(duì)羥基自由基的清除活性 裂蹄木層孔菌總黃酮對(duì)羥基自由基的清除能力如圖3所示：初始時(shí),對(duì)羥基自由基的清除率隨總黃酮濃度的增加而增加；當(dāng)濃度達(dá)到153 μg/mL時(shí)，清除率顯著提高；當(dāng)濃度達(dá)到382 μg/mL后，隨著總黃酮濃度的增加，清除率增速很慢.

圖3 不同濃度總黃酮溶液對(duì)羥基自由基的清除率

3.2.3對(duì)超氧陰離子自由基的清除活性 裂蹄木層孔菌總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力如圖4所示：初始時(shí),對(duì)超氧陰離子自由基的清除率隨濃度的增加而增加；當(dāng)濃度達(dá)到153 μg/mL時(shí)，清除率達(dá)到最高，為70.92%；之后，隨著總黃酮濃度的增加，清除率出現(xiàn)緩慢下降.

圖4 不同濃度總黃酮溶液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率

4 結(jié)論

本文用70%乙醇提取裂蹄木層孔菌總黃酮,以蘆丁為對(duì)照品，建立了用紫外分光光度法測(cè)定裂蹄木層孔菌中總黃酮含量的方法，并測(cè)得裂蹄木層孔菌中總黃酮的含量為37.9 mg/g.本文方法的平均加標(biāo)回收率為100.60%,因此可作為裂蹄木層孔菌中總黃酮含量測(cè)定的一種方法.研究結(jié)果表明，裂蹄木層孔菌中的總黃酮對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基均有一定的清除能力，其清除作用隨著黃酮濃度的增加而表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系.當(dāng)裂蹄木層孔菌總黃酮濃度為76.2 μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率最高，為92.57%；當(dāng)總黃酮濃度為382 μg/mL時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率最高，為34.05%；當(dāng)總黃酮濃度為153 μg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率最高，為70.92%.

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