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酶催化動力學光度法測定銅(Ⅱ)

2014-08-06 05:47柳暢先朱苗苗
關(guān)鍵詞:反應(yīng)速度標準溶液尿素

柳暢先,朱苗苗,王 藝

(中南民族大學 化學與材料科學學院,武漢 430074)

銅是人體內(nèi)的微量元素之一,但過量攝入會產(chǎn)生危害,銅對水生生物有較大影響.銅的毒性與其形態(tài)有關(guān),游離Cu2+的毒性大于絡(luò)合銅,故Cu2+含量是食品試樣和水質(zhì)監(jiān)測的重要指標.近30年來酶反應(yīng)動力學和酶催化作用的應(yīng)用研究很活躍[1-3],酶法可測定在酶促反應(yīng)中作為底物、輔酶、激活劑和抑制劑而存在的物質(zhì).如Chen等[4]研究了抑制劑對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的影響,用可見分光光度法和液相色譜法測定抑制劑并比較了這兩種方法;Li等[5]將醇脫氫酶固定在毛細管中,用熒光法考察輔酶的變化以測定酒精含量,檢測限1.1 g/L,變異系數(shù)為1.9%;Cheng等[6]用修飾酶電極檢測廢水中的葡萄糖,僅用不到5s的響應(yīng)時間,有良好的靈敏度和準確性.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

分光光度計(721型,上海第三分析儀器廠),精密pH計(PHS-3C型,上海雷磁儀器廠),分析天平(FA-2004型,上海精科天平廠),磁力攪拌器(78-1型,金壇市科興儀器廠).

銅(Ⅱ)標準溶液(10.0 mmol/L):稱取0.125 g CuSO4·5H2O于燒杯中,加水溶解后定容至50 mL.尿素標準溶液(1.50 mol/L),脲酶(0.8 U/L),磷酸鹽緩沖溶液(0.25 mol/L, pH=6.8).納氏試劑[7]:稱取8 g氫氧化鈉溶于25 mL蒸餾水,冷卻到室溫;另稱取5 g碘化汞和3.5 g碘化鉀溶于15 mL水;將該溶液緩緩注入上述溶液中,加水至50 mL,攪拌,密塞保存.

1.2 實驗方法

于Ep管中加入200 μL 0.25 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH=6.8),200 μL 1.50 mol/L尿素標準溶液,一定量的銅(Ⅱ)標準溶液,40 μL 0.8 U/L脲酶液后混勻,反應(yīng)2 min,加入100 μL 3 mol/L硫酸溶液后混勻,移至10 mL比色管,用水稀釋至刻度,加入1 mL納氏試劑,測定425 nm處吸光度變化值(尿素水解產(chǎn)物與納氏試劑反應(yīng)生成紅色氨絡(luò)合物[7],在425 nm處有最大吸收),計算酶促反應(yīng)速度.

v=△A×V/(△t×ε×b),

式中v為酶促反應(yīng)速度(酶活力,μmol/min),△A為吸光度變化值,V為比色管中溶液總體積(mL),△t為反應(yīng)時間(min),ε為摩爾吸光系數(shù)(L/cm·mmol),b為比色皿厚度(cm).相對酶活力=(酶活力/酶活力最大值)×100%.

根據(jù)米氏方程可求出抑制劑含量:

1/v=kc+a,

式中v為酶促反應(yīng)速度(μmol/min),c為抑制劑濃度(μmol/L),k和a為常數(shù).

2 結(jié)果與討論

2.1 測定波長的影響

在390~480 nm內(nèi)測定酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜,結(jié)果發(fā)現(xiàn)最大吸收波長為425 nm(見圖1),若無其它雜質(zhì)吸收峰的干擾,選擇425 nm作為測定波長.

λ/nm圖1 波長對吸光度的影響Fig.1 The effect of the wavelength on the absorbance

2.2 反應(yīng)溶液pH和溫度的影響

在pH 6~8內(nèi)測定了溶液pH值的影響(見圖2a),pH為6.8時酶促反應(yīng)速度最大,推測這時酶處于最佳的空間構(gòu)象和解離狀態(tài).溫度對酶活性有顯著影響(見圖2b),溫度升高時,有更多的分子成為活化分子,使酶的活力增大,故酶促反應(yīng)速度增大.但溫度過高時,由于酶蛋白的熱變性致使酶逐漸喪失活力,反應(yīng)速度下降.按實驗方法在0~80℃范圍內(nèi)測定了溫度對酶促反應(yīng)速度的影響,最適溫度為60℃.

(a) pH值;(b) 溫度圖2 反應(yīng)溶液pH和溫度對酶活力的影響Fig.2 The effect of pH and temperation of reacting solution on the enzyme activity

2.3 底物濃度的影響

測定酶促反應(yīng)中作為抑制劑存在的物質(zhì)含量,保證高靈敏度的前提是無抑制劑存在時酶促反應(yīng)速度盡可能大.考察了底物尿素濃度的影響(見圖3),尿素濃度增加到25 mmol/L以后,酶促反應(yīng)速度達最大值并基本保持不變.

圖3 尿素濃度對酶活力的影響 Fig.3 The effect of concentration of urea on the enzyme activity

2.4 共存組分的影響

試驗了常見金屬離子K+,Na+,Ca2+,Mg2+,Zn2+,Cd2+,Ni2+,Pb2+對測定的影響,發(fā)現(xiàn)Ca2+,Mg2+,Zn2+,Cd2+,Ni2+,Pb2+也對酶促反應(yīng)速度有抑制,但比銅(Ⅱ)的抑制作用要小得多,以0.3 μmol/L銅(Ⅱ)進行干擾試驗,相對誤差在±5%之內(nèi)時,共存組分允許量為:Zn2+(380倍),Ca2+(300倍),Mg2+(190倍),Ni2+(190倍),Cd2+(90倍),Pb2+(70倍).

2.5 抑制劑標準曲線

按實驗方法測定系列銅(Ⅱ)標準溶液的酶促反應(yīng)速度,標準曲線見圖4,回歸方程為:1/v= 0.716+7.66c,R=0.9986,線性范圍:0.09~20 μmol/L,檢出限為0.05μmol/L.

圖4 銅(Ⅱ)標準曲線Fig.4 The standard curve of Cu(Ⅱ)

2.6 試樣測定

平行5次測定了模擬樣(基體為湖水)中Cu2+含量,并進行加標回收,由表1可見,結(jié)果的精密度(RSD<5%)和準確度(回收率在95%~105%之間)較好.

表1 試樣測定及加標回收結(jié)果(n=5)

參 考 文 獻

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