楊宏志，王瑞峰

（黑龍江八一農墾大學食品學院，大慶 163319）

沙棘又名黑刺、黃酸刺，是胡頹子科沙棘屬的灌木亞喬木[1]。沙棘是藥食兩用植物，其中富含大量的營養(yǎng)物質及生物活性物質，主要有多糖類、黃酮類、有機酸、氨基酸及微量元素等[2]。沙棘中的黃酮物質主要集中在沙棘葉中，其具有抗衰老、清除體內自由基、增強免疫、抗疲勞等生理功能[3]。近年來，關于沙棘葉總黃酮的利用和研究收到廣泛的關注，其應用范圍也越來越廣，如保健品、飲料、藥品等[4]。

大孔樹脂又稱全多孔樹脂，具有空間立體多空的結構，吸附能力較強，能夠吸附許多芳香族物質，還具有選擇性強、操作簡單、再生方便、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，現已被應用植物中生物活性成分的分離純化，如生物堿、內酯、總黃酮等化合物[5]。目前有關大孔樹脂分離沙棘葉總黃酮的研究較少，本實驗主要研究D101、XAD-7PH、D3520、NKA-9、X-5、D4020、AB-87七種大孔樹脂對沙棘葉總黃酮的吸附與解析特性，選出最佳樹脂，以期為沙棘葉總黃酮開發(fā)利用提供科學依據，為沙棘葉總黃酮的工業(yè)化生產提供理論參考。

1 試驗材料與儀器

1.1 試驗材料

沙棘葉總黃酮粗提液，來自黑龍江八一農墾大學食品學院，蘆丁標品，純度為98.5%，成都邦成生物工程公司，乙醇、亞硝酸鈉、甲醇、鹽酸、氫氧化鈉等均為分析純，D101、XAD-7PH、D3520、NKA-9、X-5、D4020、AB-8 等樹脂均購自南開大學化工廠。

1.2 試驗儀器

T6 紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司、HL-2B 數顯恒流泵購自上海市精科儀器公司；SG2 型pH 計，日本島津；BS-100A 數控計滴自動部分收集器，北京中勝儀器設備有限公司；色譜柱Ф1.6×20 cm，色譜柱Ф2.0×30 cm 均來自北京飛美斯公司。

2 試驗方法

2.1 大孔吸附樹脂的預處理

剛出廠的樹脂中含有防腐劑、分散劑等雜質，故因此在使用前必須要經過除雜處理。將樹脂在水中浸泡24 h，使其充分溶脹[6]。之后將其置于無水乙醇中浸泡24 h，用蒸餾水沖洗至無乙醇味；采用濕法進行樹脂裝柱，之后用無水乙醇將樹脂所含的雜質沖洗干凈，再用去離子水將剩余的乙醇沖洗干凈；使用5%鹽酸清洗樹脂柱，使其以2 BV·h-1流速流過樹脂；再使用5%的氫氧化鈉清洗樹脂柱，流速為2 BV·h-1，并將清洗好的樹脂置于真空干燥箱中，進行干燥處理（約40 ℃），之后置于干燥器中備用[7]。

2.2 樣品液的預處理

將使用適當濃度的乙醇對沙棘葉中總黃酮進行提取，制成澄清的上清液，可以避免雜質染堵塞樹脂，不但能夠提高純化率，還可以延長樹脂的使用時間。樣品液中所含沙棘葉總黃酮的濃度為10.51 mg·mL-1。

2.3 總黃酮含量的測定方法

準確稱取2.000 1 g 在105 ℃條件下干燥的蘆丁標準品，添加甲醇并置于水浴鍋中加熱，使其溶解，待溫度降到室溫后，加入甲醇定容至100 mL。分別準確量取蘆丁標準溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0 和5.0 mL置于10 mL 的容量瓶中，再分別加入1 mL 濃度為5%的三氯化鋁甲醇溶液，6 mL 蒸餾水并加入甲醇定容至10 mL。之后在430 nm 波長下對其進行吸光度測定[8]。蘆丁標準品濃度C 為橫坐標，吸光度值A 為縱坐標，繪制標準曲線圖如圖1 所示：

用最小二乘法進行線性回歸，得回歸方程：

此方程的相關系數r=0.999 6。

圖1 蘆丁標準曲線圖Fig.1 The standard curve of aloes

此式中：C－樣品濃度（mg·mL-1）；

A－吸光度值；

R－回歸系數。

根據標準曲線計算提取液中總黃酮的濃度C，然后可以計算出沙棘葉中總黃酮提取的得率。公式如下：

2.4 大孔樹脂的初步篩選

試驗選取7 種適合分離沙棘葉總黃酮的大孔吸附樹脂，從中選出最優(yōu)樹脂用于分離總黃酮。

2.4.1 樹脂的靜態(tài)吸附量測定

準確稱取7 種經預處理的干樹脂D101、X-5、NKA-9、AB-8、D4020、D3520 和XAD-7HP 各10 mL，置于250 mL 具塞錐形瓶中，加入100 mL 濃度為C1的沙棘葉中總黃酮的樣品液，在30 ℃下，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，頻率設定為130 n·min-1，過濾，可以得到濾中黃酮的濃度（C2）[9]。

樹脂的靜態(tài)吸附率計算公式如下：

式1 中：A吸附——吸附率，%；

C1——總黃酮初始濃度，mg·mL-1；

C2——總黃酮剩余濃度，mg·mL-1。

按下式計算靜態(tài)飽和吸附量：

式2 中：M——吸附量，mg·g-1；

C1——總黃酮初始濃度，mg·mL-1；

C2——總黃酮剩余濃度，mg·mL-1；

V——樹脂體積，mL；

M——樹脂質量，g。

2.4.2 靜態(tài)解析率的測定

將吸附達到飽和狀態(tài)的樹脂過濾，用蒸餾水清洗樹脂，除去殘留的溶液，精確加入70%的乙醇溶液100 mL，震蕩處理24 h，然后將解吸液過濾出來，測定其中的總黃酮含量，以此來計算其解吸率[10]。

解吸率計算公式如下：

公式3 中：B——解吸率，%

Cn——洗脫液濃度，mg·mL-1；

Vn——洗脫液的體積，mL；

M——靜態(tài)飽和吸附量，mg·g-1；

m——樹脂質量，g。

2.5 洗脫條件及靜態(tài)吸附條件的確定

2.5.1 吸附溫度對沙棘葉總黃酮吸附量的影響

取15 mL 經預處理的樹脂，裝入到250 mL 三角瓶，加入100 mL 含有沙棘葉總黃酮的溶液，震蕩處理10 h，進行吸附，溫度設定為15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃和55 ℃。計算總黃酮的濃度，從而算出吸附率和吸附液濃度，以此得出最優(yōu)吸附溫度[11]。

2.5.2 吸附時間對沙棘葉總黃酮吸附量的影響

取15 mL 經預處理的樹脂，裝入到250 mL 三角瓶，加入100 mL 含有沙棘葉總黃酮的溶液，在45 ℃下震蕩10 h，進行吸附。每隔1h 收集上清液，計算總黃酮的濃度，從而算出吸附率和吸附液濃度，以此得出最優(yōu)吸附時間。

2.5.3 洗脫溫度對沙棘葉總黃酮解吸率的影響

量取15 mL 吸附總黃酮達到飽和狀態(tài)的樹脂7份，用去離子水對其進行清洗，置于7 支250 mL 的三角瓶中，分別加入100 mL 75%的乙醇，將溫度調節(jié)為15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃和55 ℃，振蕩洗脫10 h。收集上清液，檢測其中總黃酮含量，計算出解吸率，由解吸率得出最適洗脫溫度。

2.5.4 洗脫時間對沙棘葉中總黃酮解吸率的影響

量取15 mL 吸附總黃酮達到飽和狀態(tài)的樹脂，用去離子水對其進行清洗，置于250 mL 的三角瓶中，加入100 mL 75%的乙醇，溫度為25 ℃，震蕩洗脫10 h，每1 h 吸取上清液，檢測其中總黃酮含量，計算出解吸率，由解吸率得出最適洗脫時間。

2.5.5 乙醇濃度對沙棘葉中總黃酮解吸率的影響

量取15 mL 吸附總黃酮達到飽和狀態(tài)的樹脂，用去離子水對其進行清洗，置于250 mL 的三角瓶中，分別加入100 mL 濃度為25%、35%、45%、55%、65%、75%乙醇100 mL，震蕩洗脫10 h。檢測其中總黃酮含量，計算出解吸率，由解吸率得出最適乙醇濃度。

2.6 大孔樹脂動態(tài)吸附試驗

2.6.1 上樣速率對總黃酮吸附效果的影響

將已制好的150 mL 樹脂濕法裝入色譜柱（40 cm×2.0 cm）中，將總黃酮粗提液作為上樣液，并且控制粗提液流出液的速度，分別為1.0、2.01、3.0、4.0、5.0、6.0 mL·min-1，收集流出液，采用HPLC 法檢測，當洗脫液濃度與上樣液濃度相同時，停止上樣，計算其中所含總黃酮的量，通過總黃酮的量及流出液的體積計算出每毫升樹脂所能夠吸附總黃酮的量，從而確定最佳速率。

2.6.2 上樣液濃度對總黃酮吸附效果的影響

采用濕法進行樹脂裝柱，取已制好的150 mL 樹脂裝入色譜柱（40 cm×2.0 cm）中，將總黃酮粗提液作為上樣液，濃度為0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 mg·mL-1，吸附速率保持不變，收集流出液，采用HPLC 法檢測，當洗脫液濃度與上樣液濃度相同時，停止上樣，計算其中所含總黃酮的量，通過總黃酮的量及流出液的體積計算出每毫升樹脂所能夠吸附總黃酮的量，從而確定最佳濃度。

2.6.3 洗脫液乙醇濃度對總黃酮吸附效果的影響

采運用濕法將樹脂裝入色譜柱，在最優(yōu)吸附條件進行初級樹脂吸附，使樹脂達到飽和狀態(tài)。再對流出液進行清洗，使其在波長450 nm 的條件下沒有吸收峰，然后用5%、25%、45%、65%、85%的乙醇洗脫，速率為3 BV·h-1，乙醇的體積為4 BV。對流出液進行高效液相色譜檢測，得出解吸率，確定乙醇的最優(yōu)濃度。

2.6.4 解吸速率對樹脂作用效果的影響

對樹脂進行飽和吸附處理，再對流出液進行清洗，使其在波長450 nm 的條件下沒有吸收峰，分別取洗脫速率1、2、3 、4 和5 BV·h-165%的乙醇對樹脂進行洗脫處理，洗脫液的體積為4 BV。對流出液進行高效液相色譜檢測，得出解吸率，確定最佳解吸速率。

2.6.5 洗脫劑用量對總黃酮吸附效果的影響

對樹脂進行飽和吸附處理，再對流出液進行清洗，使其在波長450 nm 的條件下沒有吸收峰，再用65%的乙醇溶液對其進行洗脫，速率為3 BV·h-1，洗脫液體積為1、2、3、4 和5 BV。計算出對應的解吸率，確定洗脫劑的最佳用量。

3 試驗結果與分析

3.1 樹脂的初篩

靜態(tài)試驗得出7 種樹脂的解吸及吸附結果，如表1 所示：

表1 大孔樹脂靜態(tài)試驗結果Table 1 The results of the static experiment

由表1 可知，樹脂X-5 的吸附量、吸附率及解吸率都是七種樹脂中最高的，故具有較好的吸附能力。而樹脂AB-5 和D3520 的吸附能力稍差，但優(yōu)于其他四種樹脂。選取樹脂X-5、AB-5 和D3520 來進行靜態(tài)吸附及解吸的試驗，由此確定最優(yōu)樹脂材料。

3.2 樹脂洗脫條件及靜態(tài)吸附條件的選擇

3.2.1 吸附溫度的確定

吸附溫度與吸附率的影響關系如圖2 所示。由圖可以知，當吸附溫度在15～25 ℃范圍內，吸附率隨溫度的增加而增大，當溫度達到35 ℃之后，吸附率開始下降，之后隨著溫度的升高而不斷減小，這是由于較高的溫度會使黃酮性質不穩(wěn)定，從而影響吸附效果。在25 ℃時，三種樹脂的吸附率達到最大，其中樹脂X-5 的吸附率最大，吸附效果最好，此時為最適吸附溫度。

圖2 吸附溫度與吸附率的關系圖Fig.2 The relationship between adsorption temperature and adsorption rate

3.2.2 吸附時間的確定

吸附時間對吸附率的影響如圖3 所示，由圖可知吸附時間與三種樹脂的吸附率成正比，時間增加吸附率增大，但當吸附時間達到3 h 后，吸附率出現小幅下降。吸附時間為3 h 時，三種樹脂的吸附率都達到最大值，其中X-5 的吸附率最高，故吸附時間3 h為吸附的最適時間。

圖3 吸附時間與吸附率的關系圖Fig.3 The relationship between adsorption time and adsorption rate

3.2.3 洗脫溫度的確定

圖4 為洗脫溫度和洗脫效果的關系圖。圖4 中，當洗脫溫度在15～25 ℃之間時，洗脫率隨洗脫溫度的升高而增大，在25 ℃時分別達到最大值，其中樹脂AB-8 增幅最大，但此時樹脂X-5 洗脫率最大。當溫度超過25 ℃后，洗脫率隨洗脫溫度的升高而不斷減小。故25 ℃為最適洗脫溫度。

圖4 洗脫溫度對洗脫率影響Fig.4 The effects of temperature on the rate of elution

3.2.4 洗脫時間的確定

圖5 是洗脫時間和洗脫率的關系圖。圖中三種樹脂的洗脫率都隨洗脫時間的增加而增大，當洗脫時間為2.5 h 時，樹脂的洗脫率達到最大值，之后便不再增加，趨于平穩(wěn)。當洗脫時間為2.5 h 時，X-5 的洗脫率最高，為最優(yōu)樹脂，2.5 h 為最適洗脫時間。

3.2.5 乙醇濃度的確定

圖6 是乙醇濃度與解析率的關系圖。由圖可知，隨著乙醇濃度的不斷增加，三種樹脂的解析率也隨之增大，當乙醇濃度為65 ℃時解析率達到最大值，其中樹脂X-5 的解析率最大。

圖5 洗脫時間對洗脫率的影響Fig.5 The effects of the elution time to the elution rate

圖6 乙醇濃度與解吸率的關系圖Fig.6 The relationship between concentration of ethanol and desorption rate

由上述試驗可確定，樹脂X-5 為沙棘葉總黃酮分離的最佳樹脂，具有較高的吸附量、吸附率及解吸率。最優(yōu)靜態(tài)吸附的條件為：吸附溫度25 ℃，吸附時間3 h；最優(yōu)靜態(tài)解析條件為乙醇濃度65%，解析溫度為25 ℃，解析時間2.5 h。

3.3 大孔樹脂動態(tài)吸附試驗結果

3.3.1 上樣速率的確定

表2 為上樣速率與總黃酮吸附量的影響。表中所示，樹脂X-5 的吸附量隨上樣速率的增加而不斷減小，最大值為8.39 mg·mL-1，最小值為4.51 mg·mL-1。工業(yè)生產上既要考慮生產速率，也要考慮生產效率，由此選擇上樣速率2 BV·h-1為最優(yōu)上樣液的流速。

表2 上樣液流速與樹脂吸附總黃酮量的關系Table 2 The relationship between sample flow velocity and adsorption capacity

3.3.2 上樣液濃度的確定

表3 為上樣液濃度與樹脂吸附量的關系。由表3 可知，樹脂的吸附量隨著上樣液濃度的增加而不斷增大，當上樣液濃度為3 mg·mL-1時，吸附量達到最大值，之后吸附量開始不斷降低，上樣濃度過低，樹脂沒有對黃酮吸附完全，而上樣濃度過高會使樹脂堵塞，影響吸附效果。故選取上樣液的濃度為3 mg·mL-1。

表3 上樣液濃度與樹脂吸附總黃酮量的關系Table 3 The relationship between sample concentration and adsorption capacity

3.3.3 乙醇濃度的確定

表4 為乙醇的濃度與解吸率的關系。解吸率隨著乙醇濃度的增加而不斷升高，當濃度為85%時，解吸率達到最大值，為88.1%，但當乙醇濃度為65%時，解吸率為87.3%與最高時的解吸率相差不大，但乙醇的濃度降低很多，工業(yè)生產時要同時考慮效率及成本，故選用75%的乙醇進行洗脫操作。

表4 乙醇濃度與樹脂解吸率的關系Table 4 The relationship between ethanol concentration and desorption rate

3.3.4 解吸速率的選擇

解吸速率與解吸率的關系見表5。當解吸速率為1.0 BV·h-1時，解吸率為86.3%，隨著解吸速率的增大，解吸率逐漸降低，當解吸速率為5.0 BV·h-1時達到最低值72.9%。故當解吸速率為1.0 BV·h-1時，解吸率為最大值86.3%，但此時解吸速率較低，導致試驗時間延長，效率下降，故3.0 BV·h-1為最佳解吸速率。

表5 解吸速率與樹脂解吸率的關系Table 5 The relationship between desorption rate and desorption rate

3.3.5 洗脫劑用量的選擇

表6 為洗脫劑乙醇的用量與解吸率的關系。由表可知，隨著洗脫體積的增加，解吸率也不斷增大，成正比例關系。洗脫劑用量為1.0 BV 時，解吸率為42.8%，當洗脫劑用量為4.0 BV 時，解吸率增大到86.3%，之后解吸率增長幅度不大，過多的洗脫劑會影響后續(xù)工藝。因此，考慮到生產成本及洗脫效果，洗脫劑的用量選取4.0 BV。

表6 洗脫劑的用量與樹脂解吸率的關系Table 6 The relationship between the amount of eluent and resin desorption rate

由上述試驗可得出，樹脂X-5 對沙棘葉中總黃酮的動態(tài)吸附最優(yōu)條件及其解吸的最適條件。

4 結論

試驗對D101、XAD-7PH、D3520、NKA-9、X-5、D4020、AB-8 七種樹脂的吸附率及解吸率研究，得出X-5 樹脂分離沙棘葉總黃酮的效果最好。確定樹脂在25℃條件下吸附2h 時的靜態(tài)吸附效果最好；當樹脂在25 ℃，洗脫液乙醇的濃度為65%的條件下樹脂的靜態(tài)解吸效果最好。試驗得出：在上樣液濃度為3.0 mg·mL-1，吸附速率為3 BV·h-1的條件下，樹脂的動態(tài)吸附效果最佳；洗脫液乙醇的體積分數為65%，體積用量為4.0 BV，解吸速率為3 BV·h-1的條件下，獲得沙棘葉總黃酮的純度為89.72%，總黃酮含量由10.51 mg·mL-1增大到16.73 mg·mL-1，分離的效果較好。研究結果為利用大孔樹脂分離沙棘葉總黃酮的應用提供了理論支持。

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