鐘其頂，王道兵，孟 鎮(zhèn)，熊正河，王 敏

(1. 天津科技大學(xué)，天津 300457；2. 中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100027；3.全國(guó)食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心，北京 100027)

食醋是日常生活中的重要食材之一，根據(jù)工藝不同可分為釀造醋和配制醋，其中釀造醋[1]根據(jù)發(fā)酵原料不同，可以分為糧食醋和水果醋。近年來(lái)，果醋飲料由于獨(dú)特的風(fēng)味和保健作用在世界發(fā)達(dá)國(guó)家受到歡迎，被稱作“第四代黃金飲品”。在利益驅(qū)動(dòng)下，部分不法商家通過(guò)虛假標(biāo)注食醋來(lái)獲取最大市場(chǎng)利益，如將普通食醋虛假標(biāo)注為果醋。因此，需要建立一種食醋原料溯源的分析方法，以推動(dòng)食醋市場(chǎng)公平競(jìng)爭(zhēng)，保護(hù)消費(fèi)者利益。

目前，依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的物理化學(xué)等常規(guī)指標(biāo)只能判定食醋的基本質(zhì)量，難以有效溯源食醋的發(fā)酵原料[2-4]。據(jù)報(bào)道，產(chǎn)品中碳-13比值(δ13C)與其原料有密切關(guān)聯(lián)，碳同位素技術(shù)已被廣泛用于原料溯源及產(chǎn)品真實(shí)性鑒別[5-13]，因此通過(guò)測(cè)定乙酸中δ13C可溯源食醋的原料來(lái)源[14-16]。醋中有機(jī)物除乙酸外，還有多種醇、醛、酯類化合物，為避免受到其他有機(jī)物的影響，測(cè)定乙酸中δ13C時(shí)需先提純乙酸[16]。目前測(cè)定食醋中乙酸δ13C主要有兩種方法：一種是通過(guò)微蒸餾系統(tǒng)提純食醋中乙酸[16]，再采用元素分析儀-同位素質(zhì)譜(EA-IRMS)進(jìn)行測(cè)定，該方法采用的微蒸餾系統(tǒng)設(shè)備昂貴、操作步驟復(fù)雜，需盡力避免在蒸餾過(guò)程中乙酸的碳同位素分餾影響；另一種是利用氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜(GC-C-IRMS)測(cè)定單體有機(jī)物中碳同位素組成[17]，考慮到食醋中含水量高達(dá)90%以上，且含水量大的樣品不能直接進(jìn)入氣相色譜儀，因此需先采用頂空-固相微萃取技術(shù)[15-16]萃取食醋中乙酸[18-19]，然后用GC-C-IRMS分析測(cè)定，但該萃取過(guò)程存在同位素分餾作用，且隨著固相微萃取頭使用次數(shù)增加而導(dǎo)致效率降低，進(jìn)而影響測(cè)量的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度，因此該方法至今未被推廣應(yīng)用。

擺脫對(duì)復(fù)雜前處理步驟的依賴，實(shí)現(xiàn)食醋中乙酸的GC直接進(jìn)樣，是利用GC-C-IRMS技術(shù)測(cè)定乙酸碳同位素的關(guān)鍵?？紤]到食醋中乙醇含量在1.19～3.37 g/L之間[20]，而乙酸含量高于35 g/L[1]，出于增加樣品中有機(jī)相比例和降低碳同位素測(cè)定時(shí)信號(hào)強(qiáng)度的目的，本研究采用乙醇作為稀釋劑[21]，利用GC-C-IRMS直接測(cè)定食醋中乙酸的碳同位素組成。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

Triplus自動(dòng)進(jìn)樣器，Trace GC氣相色譜儀，燃燒轉(zhuǎn)化裝置，Delta V Advantage穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀(δ13C測(cè)定內(nèi)精度≤0.065‰，線性測(cè)定范圍2～10 V)：均為美國(guó)Thermo-Fisher公司產(chǎn)品。

1.2 試劑

氦氣：純度大于99.999%；乙醇：國(guó)產(chǎn)色譜純；冰乙酸：國(guó)產(chǎn)分析純，經(jīng)EA-IRMS標(biāo)定得δ13CVPDB= -26.41±0.15‰；果醋：2011年FIT-PTS第2輪國(guó)際比對(duì)樣品；6種市售食醋和1個(gè)工業(yè)醋酸的詳細(xì)信息列于表1。

1.3 色譜條件

Wax毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為氦氣；柱流速1.2 mL/min；進(jìn)樣口溫度300 ℃；升溫程序：起始溫度120 ℃，保持1 min，以15 ℃/min 升溫至200 ℃，保持2 min；進(jìn)樣體積1 μL；分流比20∶1。

1.4 乙酸轉(zhuǎn)化條件

燃燒轉(zhuǎn)化裝置(IsoLink)中配備陶瓷(Al2O3)氧化管(填料為CuO，NiO和Pt)，工作溫度為1 000 ℃，將乙酸轉(zhuǎn)化成CO2。

1.5 樣品前處理

根據(jù)穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀的測(cè)定線性范圍(2～10 V)及色譜條件，用乙醇將食醋樣品稀釋至乙酸含量約8 g/L。

表1 市售食醋和工業(yè)醋酸的詳細(xì)信息及乙酸碳同位素?cái)?shù)據(jù)(n=3)Table 1 Details of vinegar samples and acetic acid with isotope ratios measured by GC-C-IRMS(n=3)

注：*原材料代指商品標(biāo)簽所列的原料信息

2 結(jié)果與分析

2.1 保留時(shí)間的確定

同位素質(zhì)譜測(cè)定乙酸δ13C前，需通過(guò)燃燒爐裝置將乙酸轉(zhuǎn)化成CO2，為了避免稀釋用乙醇溶劑進(jìn)入燃燒爐影響乙酸轉(zhuǎn)化率，需要準(zhǔn)確測(cè)定乙醇和乙酸在氣相色譜分離中的保留時(shí)間；再根據(jù)乙醇溶劑保留時(shí)間設(shè)定反吹(backflush)參數(shù)，確保乙醇溶劑全部通過(guò)反吹排出。

將乙醇和乙酸的標(biāo)準(zhǔn)品混合物置于頂空進(jìn)樣瓶，取進(jìn)樣瓶上層的乙醇和乙酸混合氣體注入GC-C-IRMS進(jìn)行測(cè)定，得到乙醇和乙酸的44、45和46離子流圖，示于圖1。

圖1 GC-C-IRMS測(cè)定乙醇和乙酸的44，45和46離子流圖Fig.1 Ions chromatography of acetic acid and ethanol 44,45,46 determinated by GC-C-IRMS

由圖1可見(jiàn)，乙醇與乙酸可有效分離，保留時(shí)間分別為309 s和523 s，可設(shè)置在200～400 s期間打開(kāi)反吹，將乙醇溶劑峰成功排出，從而消除乙醇溶劑對(duì)乙酸δ13C測(cè)定的影響。

2.2 乙醇稀釋法測(cè)定乙酸δ13C準(zhǔn)確性研究

根據(jù)穩(wěn)定同位素測(cè)定要求，測(cè)定復(fù)雜樣品中某一種組分時(shí)，必須通過(guò)前處理技術(shù)將待測(cè)組分進(jìn)行分離、提純、轉(zhuǎn)化特定氣體(如CO或CO2)，再進(jìn)入穩(wěn)定同位素質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定。如前面提及的微蒸餾系統(tǒng)提純食醋中乙酸和固相萃取技術(shù)萃取濃縮食醋中乙酸，均屬于食醋樣品的前處理手段。本研究擬采用乙醇直接稀釋后，經(jīng)毛細(xì)管氣相色譜柱分離提純食醋中乙酸。為了驗(yàn)證乙醇稀釋前處理技術(shù)的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，模擬配制不同乙酸濃度的水溶液，測(cè)定結(jié)果列于表2。

表2 不同濃度乙酸水溶液中乙酸δ13C測(cè)定結(jié)果Table 2 δ13C-values of acetic acid in acetic acid-water solution with different contents

注：α=0.05時(shí)，t雙尾臨界為2.262 2；P為雙層檢驗(yàn)概率

從表2可見(jiàn)，5%乙酸溶液中乙酸δ13C的測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定在-26.28‰～-26.40‰之間，與冰乙酸(δ13C=-26.41‰)十分接近。分別對(duì)不同濃度的乙酸溶液同冰乙酸測(cè)定值進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P均大于0.05，說(shuō)明溶液中乙酸δ13C與冰乙酸的測(cè)定值無(wú)顯著性差異，因此，該方法可以用來(lái)測(cè)定濃度為2%～100%的乙酸溶液。

2.3 食醋中乙酸δ13C測(cè)定

選擇實(shí)際食醋樣品進(jìn)行測(cè)定，44、45和46離子譜圖示于圖2。

從圖2可見(jiàn)，食醋樣品的乙酸峰對(duì)稱均勻，與其他雜峰明顯分離，避免了未知物質(zhì)對(duì)乙酸δ13C測(cè)定的干擾。

2.4 穩(wěn)定性

2.4.1重復(fù)性分析 選擇特定食醋樣品，重復(fù)測(cè)定10次，驗(yàn)證該方法的重復(fù)性，結(jié)果列于表3。

圖2 果醋樣品乙酸δ13C分析圖譜Fig.2 Chromatogram of δ13C of acetic acid in fruit vinegar

表3 食醋中乙酸δ13C重復(fù)性測(cè)定結(jié)果Table 3 Repeatability of δ13C-values of acetic acid in vinegar

由表3可知，本方法連續(xù)10次測(cè)定食醋樣品中乙酸δ13C的標(biāo)準(zhǔn)偏差1σ=0.13‰，不僅滿足文獻(xiàn)[18]所述的純乙酸δ13C穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn)偏差σ范圍為0.1‰～0.4‰，而且達(dá)到穩(wěn)定同位素質(zhì)譜精度測(cè)試要求小于0.2‰。

2.4.2再現(xiàn)性分析 選擇某食醋樣品為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別置于4個(gè)溶劑瓶A、B、C、D中，其中A、B、C和D分別在第1天、第3天、第5天、第7天進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果列于表4。

結(jié)果表明，該方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.05‰，再現(xiàn)性較好，能滿足重復(fù)測(cè)定的要求(小于0.2‰)。

2.5 準(zhǔn)確性驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)室在2011年參加由歐盟聯(lián)合研究中心(JRC)支持的穩(wěn)定同位素實(shí)驗(yàn)室間能力驗(yàn)證計(jì)劃(FIT-PTS)。實(shí)驗(yàn)室按照本研究所建立的乙醇溶劑稀釋法結(jié)合氣相色譜-同位素質(zhì)譜(GC/IRMS)測(cè)定歐盟郵遞的以水果為原料的食醋中乙酸δ13C，結(jié)果列于表5。

由表5可見(jiàn)，通過(guò)不同時(shí)間的再現(xiàn)性測(cè)試，樣品中乙酸的δ13C均十分穩(wěn)定，平均值為-25.66，不同天數(shù)12次測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.06‰，符合測(cè)定要求。本實(shí)驗(yàn)室向歐盟提交了果醋中乙酸δ13C的測(cè)試結(jié)果(實(shí)驗(yàn)室編號(hào)D6)，并得到了數(shù)據(jù)反饋，列于表6和圖3(除D6外，其余7個(gè)實(shí)驗(yàn)室均采用微蒸餾裝置將乙酸從食醋中提純后,再用EA-IRMS進(jìn)行測(cè)定)。

表4 食醋中乙酸δ13C再現(xiàn)性測(cè)定結(jié)果Table 4 Reproducibility of δ13C-values of acetic acid in vinegar

表5 果醋中乙酸δ13C重復(fù)性測(cè)定結(jié)果Table 5 Repeatability of δ13C-values of acetic acid in fruit vinegar

表6 FIT-PTS國(guó)際實(shí)驗(yàn)室比對(duì)結(jié)果Table 6 Results of FIT-PTS inter-laboratory comparison study

圖3 FIT-PTS項(xiàng)目中果醋樣品乙酸δ13C的標(biāo)準(zhǔn)得分(z-Score)圖Fig.3 z-Score for δ13C of acetic acid in vinegar

由表6和z-score可知，編號(hào)為D1、D3和D4的實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果明顯偏離(≤-2σ或≥2σ)，超出正常波動(dòng)測(cè)定范圍。剔除上述3個(gè)離散數(shù)據(jù)后，其余數(shù)據(jù)的平均值為-25.83‰，1σ=0.15‰，與本方法測(cè)得的結(jié)果相差0.17‰，達(dá)到國(guó)際實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)的能力驗(yàn)證范圍(小于0.3‰)。通過(guò)本次國(guó)際間比對(duì)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，當(dāng)前采用微蒸餾提純食醋中乙酸的方法在不同實(shí)驗(yàn)室間仍存在較大偏差，穩(wěn)定性和操作誤差仍有待提高；同時(shí)，本研究所建立的GC-C-IRMS方法適用于食醋中的乙酸同位素測(cè)定，結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便快捷。

2.6 食醋樣品分析

應(yīng)用本方法測(cè)定表1中列出的市售食醋樣品及工業(yè)醋酸中乙酸δ13C。結(jié)果表明，食醋的原料不同時(shí)，乙酸δ13C也有差異，B與C均為米醋，但B中加入了食用醋酸使得乙酸δ13C偏正，該食用醋酸可能由玉米等C3植物發(fā)酵而來(lái)；D與E均為老陳醋(3年)，乙酸δ13C不同可能是由于不同產(chǎn)品中原料(配比)不盡相同；G為工業(yè)醋酸，其δ13C最偏負(fù)。由此可知，根據(jù)食醋中乙酸δ13C可溯源其發(fā)酵原料，也可定性鑒別食醋中是否含有工業(yè)醋酸。

3 結(jié)論

采用乙醇作為稀釋溶劑，基于毛細(xì)管氣相色譜柱分離技術(shù)，可在不引起食醋中乙酸碳同位素分餾的情況下進(jìn)行分離純化，通過(guò)燃燒爐和穩(wěn)定同位素質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)對(duì)食醋中乙酸δ13C的準(zhǔn)確測(cè)定。該方法的精密度和穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確性高、操作簡(jiǎn)便快速，適合推廣應(yīng)用，為我國(guó)進(jìn)一步規(guī)范食醋和果醋市場(chǎng)提供技術(shù)支撐。

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