王 丹, 曾順澤, 彭 果, 姜青貴, 何 浪

(成都醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系,四川成都610083)

手性苯乙醇及其衍生物是合成多種手性藥物如R-地諾帕明、R-托莫西汀、S-氟西汀、R-沙丁胺醇等的重要中間體[1].為獲得光學(xué)活性純的苯乙醇,應(yīng)用最廣的是化學(xué)催化不對稱合成法[2-4].近年來,生物催化因反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物立體選擇性高、對環(huán)境友好等優(yōu)點成為獲得光學(xué)活性產(chǎn)物的另一種有效途徑[5-8].目前,生物法不對稱還原前手性芳香酮的相關(guān)報道較多[9-11],但仍然無法實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的原因之一就是生產(chǎn)菌株催化活性不穩(wěn)定、產(chǎn)物積累量不高及立體選擇性較差.并且,篩選到的菌株催化產(chǎn)物大多為S-構(gòu)型[12-14],R-構(gòu)型較少.為獲得光學(xué)活性苯乙醇的高產(chǎn)菌株,我們將薄層色譜TLC分析法應(yīng)用到苯乙醇產(chǎn)生菌株的篩選工作中,成功篩選到一株可將苯乙酮不對稱還原合成R-苯乙醇的菌株cmq6-8,根據(jù)該菌株的26SrDNADl/D2區(qū)域分析的結(jié)果,并結(jié)合菌株cmq6-8的部分生理生化特征,初步鑒定cmq6-8為解脂耶氏酵母菌,為下一步的發(fā)酵條件和轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化,以及生物催化不對稱合成R-苯乙醇及其衍生物的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論及技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 樣品成都某手性化工廠污水處理池附近采集的土壤樣品及本實驗室保存菌株.

1.2 菌株的分離與純化首先將采集的土壤樣品配制成懸液,適當稀釋后涂布于篩選培養(yǎng)基,30℃,培養(yǎng)3～5 d后挑取形態(tài)各異的單菌落轉(zhuǎn)接于PDA斜面上,30℃,培養(yǎng)3～5 d后于4℃保存,備用.

1.3 菌體培養(yǎng)用無菌牙簽從PDA斜面上挑取少量菌苔接種于20 mL種子培養(yǎng)基中,30℃,170 r/min,搖床(上海智城分析儀器制造有限公司,ZHWY-211C型)培養(yǎng)24 h后再按5%的接種量接入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃,170 r/min,搖床培養(yǎng)48 h,備用.

1.4 生物轉(zhuǎn)化收集發(fā)酵液,于6 000 r/min、4℃、離心10 min.將菌體沉淀用pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液洗1～2次后,將5 g濕菌體轉(zhuǎn)接入20 mL pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液中,按體積分數(shù)2%和終濃度108 mmol/L加入葡萄糖和底物苯乙酮,30℃、170 r/min轉(zhuǎn)化48 h.轉(zhuǎn)化結(jié)束后,按體積比1∶1的量向轉(zhuǎn)化體系中加入乙酸乙酯,充分震蕩后,靜止2～3 min,于6 000 r/min,4℃,離心10 min,取上清液進行TLC檢測.

1.5 TLC分析(初篩)將鋪好的硅膠薄層板放在烘箱中,按照50℃、30 min;80℃、30 min;110℃、1 h的步驟進行活化.活化后放于干燥器中冷卻,備用.在距離薄層板底部邊沿約3 cm處,用鉛筆輕輕劃一條直線為點樣線,并用鉛筆標識點樣點,點樣量為0.2 mL.展開劑為甲苯和乙酸乙酯的混合液(體積比V甲苯∶V乙酸乙酯=4∶1),展開時間為8 min,之后用254 nm UV照射及碘蒸氣熏蝕2種方法顯現(xiàn)底物苯乙酮及產(chǎn)物苯乙醇所產(chǎn)生的斑點.最后根據(jù)斑點的大小和顯色的深淺對菌種的轉(zhuǎn)化能力進行初步判斷.

1.6 GC分析(復(fù)篩)選取出現(xiàn)產(chǎn)物苯乙醇斑點且斑點較大、顏色較深的菌株進入復(fù)篩.菌體培養(yǎng)及生物轉(zhuǎn)化過程同上.轉(zhuǎn)化還原反應(yīng)結(jié)束后,反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取(1∶1,體積比),再用無水Mg-SO4干燥后進行GC分析.使用GC-960氣相色譜儀,HP Chiral 10%3-Cyclodextrin手性色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm);檢測條件:載氣為氮氣,進樣器、色譜柱和FID檢測器溫度分別為220、110和200℃;分流比為1∶100;進樣量為0.1 mL.分別以底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的對映體過量值表示反應(yīng)的轉(zhuǎn)化程度和立體選擇性,其表達式為

其中,c0為底物的初始濃度,c苯乙醇為反應(yīng)終止時的產(chǎn)物濃度,cR和cS分別為R-型和S-型產(chǎn)物的濃度.

1.7 催化活性穩(wěn)定性實驗將菌株連續(xù)傳代20次,在0～4℃的冰箱中保存.再從每一代的斜面培養(yǎng)基上刮1滿環(huán)菌苔于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化,過程同上.再通過GC檢測其底物的轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)物的對映體過量值.

1.8 菌落形態(tài)及生理特征分析利用肉眼及顯微鏡觀察固體平板上的菌落形態(tài)及細胞,并根據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊》[15]所列的酵母菌種鑒定方法進行生化特征分析.

1.9 分子生物學(xué)鑒定

1.9.1 酵母基因組DNA提取 參考《酵母基因組提取試劑盒》的操作說明,提取酵母基因組DNA.

1.9.2 26SrDNAD1/D2區(qū)域的PCR擴增26SrDNAD1/D2區(qū)域的PCR擴增采用通用引物對NL1(5′-GCAT CAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)PCR 反應(yīng)體系(50 μL):10×PCR 緩沖液,5 μL;Mg2+(5 mmol/L),3 μL;dNTP(各 2.5 mmol/L),4 μL;引物(10 μmol/L)各 1 μL;TaqDNA 聚合酶 0.5 μL;模板DNA 2.0 μL;去離子水33.5 μL.擴增程序為:94 ℃、10 min,94℃、1 min,50℃、1 min,72 ℃、1 min;35個循環(huán)后72℃、10 min.取5 μL產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠(含GV染料)電泳,紫外燈下觀測結(jié)果.

1.9.3 序列分析和系統(tǒng)樹的構(gòu)建 將擴增出的PCR產(chǎn)物40 μL,送華大基因公司(北京)完成測序工作.根據(jù)供試菌株的26SrDNA序列,運用Blast程序在GenBank數(shù)據(jù)庫中分別進行同源序列搜索.根據(jù)同源序列搜索的結(jié)果,下載相關(guān)菌種的26SrDNA序列,與供試菌株的序列一同用Clustal X 1.83軟件進行多序列比對,結(jié)果采用MEGA3.1中的鄰接法進行系統(tǒng)樹的構(gòu)建,并用Bootstrap對進化樹進行1 000次可信度分析.

1.10 各種培養(yǎng)基篩選用培養(yǎng)基(底物誘導(dǎo)):苯乙酮1 g/L,蛋白胨 1 g/L,(NH4)2SO41 g/L,瓊脂粉17 g/L,蒸餾水1000 mL,pH自然;斜面培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200 g/L,葡萄糖 20 g/L,瓊脂粉17 g/L,蒸餾水 1 000 mL,pH自然;種子培養(yǎng)基(YPD):葡萄糖 10 g/L,酵母膏 5 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7;發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨 10 g/L,酵母膏5 g/L,葡萄糖20 g/L,(NH4)2SO4g/L,KH2PO42 g/L,蒸餾水1 000 mL,pH 7.上述培養(yǎng)基的滅菌條件均為115℃、30 min.

1.11 主要試劑與藥品苯乙酮、R/S-苯乙醇、硅膠GF254均購自成都蜀都化學(xué)試劑公司,純度為99%;S-苯乙醇、R-苯乙醇標準品購自Sigma-Aldrich,手性選擇性≥99%(對映體總和,氣象色譜GC);其它試劑均為市售分析純或生物試劑.

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株篩選分離純化篩選培養(yǎng)基以苯乙酮作為唯一碳源,獲得菌落形態(tài)各異的菌株共224株,同本實驗保存的34酵母菌一起作為R-苯乙醇高產(chǎn)菌株的供試菌.

2.2 苯乙醇高產(chǎn)菌株篩選應(yīng)用搖瓶培養(yǎng)配合TLC檢測方法,初步挑選在硅膠板上形成的斑點直徑大且顏色深的8株菌進行氣相色譜分析(圖1).其中,菌株cmq6-8的結(jié)果最好,GC檢測顯示,cmq6-8可將苯乙酮不對稱合成的R-苯乙醇,底物轉(zhuǎn)化率為49.42%,產(chǎn)物對映體過量值為94.81%.

圖1 氣相色譜檢測cmq6-8催化苯乙酮的不對稱反應(yīng)Fig.1 Gas chromatography(GC)of reduction products by cmq6-8

2.2 催化穩(wěn)定性研究將cmq6-8連續(xù)傳20代,并分別考察子1代、子5代、子10代、子15代、子20代菌株對底物苯乙酮的不對稱催化能力,結(jié)果顯示底物轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)物的對映體過量值變化不大,分別為50% ±1.65%,95% ±0.87%(圖2),說明菌株cmq6-8催化活性相對穩(wěn)定,具有工業(yè)化應(yīng)用的潛力.

圖2 菌株傳代次數(shù)對cmq6-8不對稱還原苯乙酮影響Fig.2 Effects of strain generations on the asymmetric reduction of acetophenone by cmq6-8

2.3 形態(tài)學(xué)觀察及部分生理特征菌株cmq6-8的菌落成圓形、邊緣整齊、乳白色、不透明、有光澤、質(zhì)地軟;顯微鏡下菌體細胞呈卵圓形、無菌絲體、未見出芽,有子囊孢子、有擲孢子產(chǎn)生;糖發(fā)酵試驗:麥芽糖+,葡萄糖+,乳糖-;碳源同化試驗:麥芽糖+,乳糖V,甘露醇V;未形成類淀粉化合物;在葡萄糖濃度為50%時菌體未生長;可以分解尿素.

2.4 26SrDNAD1/D2區(qū)域序列分析PCR獲得了菌株cmq6-8的26SrDNAD1/D2區(qū)域基因的部分片斷,利用BLAST軟件將該序列與GenBank中收錄的DNA序列進行比對,并與相關(guān)菌種構(gòu)建進化樹(圖3).圖中顯示cmq6-8與解脂耶氏酵母ATCC 18942(AF335986)聚成一支,序列同源性﹥99.00%,表明兩者親緣關(guān)系最近.菌株cmq6-8的26SrDNAD1/D2區(qū)域序列長度為593 bp,其在Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中的登陸號為JQ689945.

3 討論

在生物合成手性芳香酮的相關(guān)研究中,將底物分子中的羰基不對稱還原生產(chǎn)光學(xué)活性手性醇是一條有效途徑,其中研究最為廣泛的底物就是羰基兩側(cè)分別具有苯基和烷基的物質(zhì),因此苯乙酮被視為最理想的模式底物,是檢測還原性生物催化劑的立體化學(xué)傾向性底物分子[16].本文以苯乙酮誘導(dǎo)底物,從自然界中篩選可以苯乙酮為唯一碳源,且對有機溶劑耐受的微生物,結(jié)果獲得一株解脂耶氏酵母cmq6-8,其催化產(chǎn)生的產(chǎn)物為R-苯乙醇.解脂耶氏酵母是非常規(guī)酵母菌的典型代表,它的最大特點就是底物范圍較廣,目前常被用于研究油脂廢水的生物防治,而利用解脂耶氏酵母進行不對稱催化的相關(guān)報道較少.在以菌株cmq6-8全細胞為催化劑,不對稱還原苯乙酮合成R-苯乙醇的反應(yīng)中,當?shù)孜锉揭彝馁|(zhì)量分數(shù)為108 mmol/L時,靜息細胞量為0.25 g/mL,添加的輔助底物葡萄糖質(zhì)量分數(shù)為2%,轉(zhuǎn)化體系初始pH值為7,30℃轉(zhuǎn)化48 h時,底物轉(zhuǎn)化率為49.42%,產(chǎn)物R-苯乙醇的對映體過量值為94.81%.下一步將通過發(fā)酵條件和轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化等手段進一步提高底物的轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)物的對映體過量值,為該方法的工業(yè)化提供理論及技術(shù)依據(jù).

圖3 基于26SrDNA D1／D2區(qū)域序列和鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig．3 Phylogenetic tree based on 26SrDNA D1／D2 domain sequences constructed with the neighbor-joining method alignment

另外,本實驗將薄層色譜TLC引入R-苯乙醇產(chǎn)生菌株的篩選工作中,結(jié)果表明TLC檢測雖然只是一種定性檢測方法,但樣品在薄層板上顯色的深淺及斑點的大小都與底物的轉(zhuǎn)化率呈正相關(guān).因此,可優(yōu)先選擇硅膠板上直徑較大、顏色較深斑點的菌株進行GC色譜檢測,這不僅可有效的減少復(fù)篩的工作量,而且縮短篩選周期,是一項有益的嘗試.

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