張佳佳 ，朱可奇，巫 軍，王開義

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江 寧波 315200； 2.浙江省寧波市第一醫(yī)院，浙江 寧波 315010；3.寧波生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，浙江 寧波 315800）

黃疣海參 Holothuria（Thymiosycia）hilla，屬棘皮動(dòng)物門（Echinodermata）海參綱（Holothuroidea）木盾手目（Aspidochirotida）海參科（Holothuriidae）海參屬（Holothuria），分布于西太平洋及孟加拉灣以東之印度洋海域，在我國(guó)南海珊瑚礁區(qū)有大量分布[1]。筆者對(duì)其體內(nèi)的皂苷類成分進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，本研究中報(bào)道從黃疣海參體內(nèi)分離得到的海參皂苷hillaside A和hillaside B的抗真菌及抗腫瘤活性。

1 儀器、試藥與樣本

Varian Inova－600型核磁共振儀；Bruker Vector 22型紅外光譜儀；Sephadex－LH－220（Pharmacia 公司）；Quatrro 質(zhì)譜儀（Micromass公司）XT5型顯微熔點(diǎn)儀（溫度未校正，北京市科儀電光儀器廠）；HPLC儀，包括 Aglient 1100 Series，RID檢測(cè)器（Aglient公司）。HPLC洗脫劑為色譜純甲醇；其余試劑均為分析純。MJX－350S型智能霉菌培養(yǎng)箱（無(wú)錫億虹實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；THZ－82A型臺(tái)式恒溫振蕩器（上海百典儀器設(shè)備有限公司）；RT－2100C型酶標(biāo)分析儀（北京普朗儀器有限公司）。

DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；磺酰羅丹明B（sulforhodamine B，SRB）、Tris base unbuffer和三氯醋酸 （TCA）均購(gòu)自Sigma公司；注射內(nèi)環(huán)磷酰胺（上海華聯(lián)制藥集團(tuán)）；細(xì)胞株為國(guó)際通用的腫瘤細(xì)胞株(上海生物化學(xué)所細(xì)胞庫(kù))；ATCC標(biāo)準(zhǔn)株（上海長(zhǎng)征醫(yī)院菌種保存中心）；臨床株（浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥理研究中心）。陽(yáng)性對(duì)照品氟康唑（fluconazole）和酮康唑（ketoconazole）由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院有機(jī)化學(xué)教研室提供。

黃疣海參采集于福建省東山島附近海域，采集時(shí)間2010年9月，經(jīng)中國(guó)海洋大學(xué)海洋化學(xué)教研室鑒定，標(biāo)本現(xiàn)存放于浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校海洋藥物實(shí)驗(yàn)室。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取、分離及結(jié)構(gòu)鑒定

將新鮮采集的黃疣海參（65 kg）洗凈、絞碎，用95%乙醇回流提取3次，醇提物分散于水中，用石油醚反復(fù)脫脂多次，水相用正丁醇萃取3次后濃縮至3 000 mL，用3 000 mL水反復(fù)洗滌去除鹽、多糖等強(qiáng)極性成分，減壓蒸干得淺棕黃色固體145 g。

取100 g用硅膠低壓柱色譜處理，以氯仿－甲醇－水（8∶2.5∶1，下層）洗脫，得到的主成分用高效液相柱色譜純化，洗脫劑為80% 甲醇，體積流量為 1.0 mL／min，色譜柱為 Zobax SB C18型ODS反相柱[2]，得到 2個(gè)化合物，其中化合物Ⅰ為 hillaside A（31.7 mg），化合物Ⅱ?yàn)?hillaside B（34.6 mg ）。

主要應(yīng)用現(xiàn)代波譜技術(shù)（IR，高分辨 2D－、3D－NMR，ESIMS，CD等）和化學(xué)手段（酸水解、酶解、脫硫、甲基化、乙?；?、還原等）鑒定以上2個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)，其均為新的三萜皂苷類化合物，化合物Ⅰ命名為 hillaside A(C41H63O17Sna)，化合物Ⅱ命名hillaside B(C41H65O17Sna)。

2.2 抗腫瘤生物活性體外篩選

采用磺酰羅丹明B蛋白染色法（SRB法）[3]。根據(jù)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速率，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞以90 μL／孔接種于96孔培養(yǎng)板，貼壁生長(zhǎng)24 h，再加入樣品溶液10 μL／孔。每個(gè)濃度設(shè)3復(fù)孔。并設(shè)相應(yīng)濃度的0.9%氯化鈉溶液溶劑對(duì)照及細(xì)胞調(diào)零孔。腫瘤細(xì)胞在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)72 h。藥物作用時(shí)間終點(diǎn)時(shí)，每孔加入50 μL 4℃預(yù)冷的TCA溶液（30%，W／V）固定細(xì)胞，TCA溶液的終濃度為10%，靜置5 min移入4℃冰箱中固定1 h，取出用去離子水沖洗5遍，室溫晾干。待96孔板室溫下晾干后，每孔加入0.4%（W／V）的 SRB染液（1%的乙酸配制）70 μL，染色 30 min后倒掉染液，用1%（V／V）乙酸沖洗4次，去除未結(jié)合的染料，室溫晾干。用100 μL非緩沖 Tris－base堿液（10 mM，pH ＝10.5）溶解與細(xì)胞蛋白結(jié)合的染料，水平搖床上振蕩20 min，采用酶標(biāo)儀540 nm處測(cè)定。按公式[腫瘤抑制率＝（對(duì)照組 OD值－治療組 OD值）／對(duì)照組OD值×100%][4]計(jì)算被測(cè)物對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，采用Logit法計(jì)算半數(shù)抑制量(IC50值)。結(jié)果表明，黃疣海參皂苷單體化合物hillaside A和hillaside B對(duì)受試的10個(gè)腫瘤細(xì)胞株均顯示很強(qiáng)的細(xì)胞毒活性[5]，IC50值為 0.15 ～ 3.20 mg／L，見表 1。

表1 hillaside A和 hillaside B體外抗腫瘤活性（IC50，μg／mL）

2.3 抗真菌活性研究

2.3.1 培養(yǎng)液和培養(yǎng)基培植

RPMI 1640 培養(yǎng)液：將 RPMI 1640 （Gibco BRL）10 g，NaHCO32.0 g，嗎啡啉丙磺酸（MOPS，Sigma） 34.5 g （0.165 mol／L），依次溶解于 900 mL的三蒸水中，在 25℃的條件下用 1 mol／L的NaOH中和，調(diào)節(jié) pH調(diào)至 7.0，定容至1 000 mL，濾除雜菌，4℃保存。

沙堡葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）：蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，瓊脂18 g，加三蒸水900 mL溶解，加入2 g／L氯霉素水溶液50 mL，調(diào)整pH至7.0，定容至1 000 mL，高壓滅菌后4℃保存。

YEPD培養(yǎng)液：酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，加三蒸水900 mL溶解，加入2 g／L氯霉素水溶液50 mL，定容至1 000 mL，高壓滅菌后4℃保存。

2.3.2 菌液制備

試驗(yàn)前，用接種圈從4℃保存的SDA培養(yǎng)基上挑取白色假絲酵母菌、新生隱球菌、近平滑念珠菌和熱帶念株菌等球狀菌少量，接種至1 mL YEPD培養(yǎng)液，于35℃，250 r／min振蕩培養(yǎng)，活化18 h，使真菌處于指數(shù)生長(zhǎng)期；再取該菌液10 μL至1 mL YEPD培養(yǎng)液中，用上述方法再次活化；18 h后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整菌液濃度至1×103～5×103個(gè)／mL。將絲狀菌接種至SDA斜面，其中皮下組織真菌和系統(tǒng)性真菌（申克孢子絲菌、煙曲霉菌）35℃，培養(yǎng)1周；淺表真菌（紅色毛蘚菌）28℃，培養(yǎng)2周，各菌種活化2次。

2.3.3 藥液制備

用二甲基亞砜將待測(cè)藥物配成質(zhì)量濃度為28.3 g／L的溶液，－20℃低溫保存，試驗(yàn)前，將藥液取出置，置于35℃溫箱中融化備用。

2.3.4 藥敏板制備

采用96孔U型板，每排1～10孔依次加入不同質(zhì)量濃度待測(cè)藥物工作液100 μL，第1孔為最高濃度，第10孔為最低濃度。制備好的藥敏板可用塑料薄膜包裹后置－70℃保存6個(gè)月以上。取制備好的藥敏板，在1～10孔加入100 μL菌工作液，第11孔中加入 100 μL無(wú)菌蒸餾水和100 μL菌工作液，作為生長(zhǎng)對(duì)照；第12孔僅加入無(wú)菌不含藥物培養(yǎng)基作陽(yáng)性對(duì)照。

2.3.5 MIC 值判定

假絲酵母菌、新生隱球菌及絲狀真菌分別于35℃孵育24 h，72 h和1周后，用酶標(biāo)分析儀于620 nm測(cè)各孔 OD值。與陽(yáng)性對(duì)照孔比，以 OD值下降80%以上的最低濃度孔中藥物濃度為MIC80（真菌生長(zhǎng)80%被抑制時(shí)的藥物濃度）。

當(dāng)藥物的 MIC80值超過(guò)測(cè)定濃度范圍時(shí)，按以下方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)： MIC80值高于最高濃度 32 μg／mL 時(shí)，計(jì)為“＞ 256 μg／mL”；MIC80值為最低濃度或在最低濃度以下時(shí)，不作區(qū)別，均計(jì)為“≤0.25 μg ／mL”。

上述試驗(yàn)平行操作2次至3次，當(dāng) MIC80值能準(zhǔn)確重復(fù)或只差1個(gè)濃度時(shí)才被接受，并以較高濃度作為 MIC80值；當(dāng) MIC80值相差2個(gè)濃度以上時(shí)，則需重新試驗(yàn)，直到符合要求為止。

2.3.6 結(jié)果

采用微量液基稀釋法[6]，以酮康唑和氟康唑作為陽(yáng)性對(duì)照，分別測(cè)定了黃疣海參提取物hillaside A和hillaside B對(duì)7種臨床常見致病真菌的體外抑菌活性，各菌株對(duì)樣品的敏感性以 MIC80值表示，見表2。結(jié)果表明，hillaside A和hillaside B對(duì)7種真菌表現(xiàn)出強(qiáng)的活性，MIC80值均小于8 μg／mL，有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

表2 hillaside A和 hillaside B的體外抗真菌活性(MIC80，μg／mL)

3 討論

具有促微管聚合活性的hillaside A和hillaside B與目前已知的6類微管穩(wěn)定劑顯示完全不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，這對(duì)目前微管穩(wěn)定劑均具有相似藥效基團(tuán)的認(rèn)識(shí)可能是一個(gè)挑戰(zhàn)。此外，與已知微管穩(wěn)定劑水溶性差、給藥途徑受限相反，這2種成分均具有良好的水溶性，如果進(jìn)一步的研究能確證其微管穩(wěn)定和抗腫瘤活性，將具有較大的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值，并可能對(duì)微管穩(wěn)定劑的構(gòu)效關(guān)系研究和傳統(tǒng)篩選方向產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

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