蔡月明， 龍 霞， 王慶文， 王 菁， 吳志成， 王偉光， 曾慧萍， 張 璐

(北京大學(xué)深圳醫(yī)院 1風(fēng)濕免疫科, 2中心實(shí)驗(yàn)室, 3安徽醫(yī)科大學(xué)北京大學(xué)深圳醫(yī)院臨床學(xué)院, 4檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518036)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性全身性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)持續(xù)的滑膜炎、明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、關(guān)節(jié)液致炎癥因子劇增和侵襲性新生血管翳形成為特點(diǎn)，晚期往往會(huì)引起嚴(yán)重的關(guān)節(jié)畸形和活動(dòng)障礙，甚至殘疾，給病人生活、工作造成極大痛苦，同時(shí)給病人家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的負(fù)擔(dān)[1-2]。RA確切病因尚未完全闡明。但RA常在早期即可出現(xiàn)患病關(guān)節(jié)骨質(zhì)疏松以及骨與軟骨的骨質(zhì)破壞，目前已經(jīng)明確破骨細(xì)胞是導(dǎo)致RA發(fā)病過(guò)程中多關(guān)節(jié)進(jìn)行性軟骨和骨質(zhì)侵蝕破壞、骨礦物質(zhì)溶解丟失的重要參與者。大量研究[ 3-4 ]證實(shí)，骨保護(hù)素(osteoprotegerin, OPG)/核因子κB受體激活因子(receptor activator of NF-κB, RANK)/核因子κB受體激活因子配體(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)系統(tǒng)是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化、成熟和凋亡最重要的信號(hào)通路。近年來(lái)，一些研究發(fā)現(xiàn)，OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)與骨代謝更新、骨侵蝕及骨礦物質(zhì)溶解丟失相關(guān)，并在骨質(zhì)疏松[5]、骨髓瘤[6]、心血管疾病[7]、腫瘤[8]、缺血性腦卒中[9]中做了研究探索，但與RA的關(guān)聯(lián)性研究較少。本研究擬通過(guò)比較OPG的基因多態(tài)性163A/G(rs3102735)及245T/G(rs3134069)在中國(guó)漢族RA人群與健康對(duì)照人群的不同分布，對(duì)OPG的基因多態(tài)性與RA發(fā)病的關(guān)系進(jìn)行探討。

材 料 和 方 法

1 研究對(duì)象

376例研究對(duì)象血樣取自2010年8月至2011年9月門診及住院的RA病人及同期進(jìn)行健康體檢的人群。其中健康對(duì)照組171人，RA組205人。健康對(duì)照組男74人(43.3%)，女97人(56.7%)，年齡22～81歲，平均(41.6±11.2)歲。 RA組男30人(14.6%)，女175人(85.4%)，年齡14～81歲，平均(48.5±14.5)歲。研究個(gè)體均為中國(guó)漢族人，無(wú)血緣關(guān)系。

RA診斷符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1987年RA分類標(biāo)準(zhǔn)。記錄患者的臨床資料，包括癥狀、體征、實(shí)驗(yàn)室檢查及治療情況?；颊叨ㄆ陔S診，每2周～1個(gè)月監(jiān)測(cè)1次血常規(guī)、肝腎功能變化。觀察半年內(nèi)病情變化情況。

2 主要試劑

PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf Mastercycler Gradient)；低溫高速離心機(jī)(Thremo Scientific Heraeus Multifuge)；恒溫加熱器(TU-10，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司 )；電熱恒溫水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；水平電泳系統(tǒng)和凝膠成像系統(tǒng)(Bior-Rad)；DNA序列合成(南京金斯瑞)；基因組DNA提取試劑盒(Blood Genome DNA Extraction Kit)和PCR擴(kuò)增試劑盒(Premix Taq Version 2.0)購(gòu)自大連寶生物公司；DNA Marker(Tiangen)；AseI和HinfI內(nèi)切酶購(gòu)自NEB。

3 主要方法

3.1DNA模板的制備 取研究對(duì)象外周靜脈血2 mL，枸櫞酸鈉抗凝，用Blood Genome DNA Extraction Kit提取DNA，按說(shuō)明書進(jìn)行操作。

3.2擴(kuò)增引物設(shè)計(jì) 以Primer 5軟件并參考文獻(xiàn)[10]設(shè)計(jì)擴(kuò)增模板的引物，設(shè)計(jì)后經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)分析。上游引物5’-CTGGAGACATATAACTTGAACA-3’，下游引物5’-CCATCATCAAAGGGCTATTGGT-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度為300 bp，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

3.3PCR反應(yīng)體系與條件 用Eppendorf Mastercycler gradient PCR擴(kuò)增儀，采用TaKaRa的Premix Taq Version 2.0反應(yīng)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增：反應(yīng)總體積30 μL，含1 μg基因組DNA，Premix Taq(dNTP 20 μmol/L，耐高溫TaqDNA聚合酶0.75 U，MgCl21.5 mmol/L)15 μL,上、下游引物各2.0 μL(5 pmol/μL)，ddH2O 8 μL，總體積30 μL。擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃終末延伸10 min。PCR反應(yīng)完成后，取5 μL產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，80 V電壓，50 min，凝膠成像儀下觀察結(jié)果并照相保存圖像。

3.4限制性核酸內(nèi)切酶酶切檢測(cè)基因型 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分2管，每管各10 μL，分別加入相應(yīng)緩沖液2 μL，ddH2O 7 μL，其中一管加入OPG 163A/G位點(diǎn)的限制性核酸內(nèi)切酶AseI 5 U，另一管加245T/G位點(diǎn)的限制性核酸內(nèi)切酶HinfI 5 U，每管總體積為20 μL，在37 ℃恒溫下水浴消化5～15 min，加入6×loading buffer 4 μL終止酶切反應(yīng)。取酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠(含0.5 g/L溴化乙啶)，70 V電壓電泳60 min，凝膠成像儀下觀察結(jié)果并照相保存圖像。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 RA組臨床特征

研究納入RA患者205人，男30人(14.6%)，女175人(85.4%)，年齡14～81歲，平均(48.5±14.5)歲，病程平均(15.4±10.2)月，超敏C反應(yīng)蛋白(high-sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)平均(11.5±22.6) mg/L，類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor,RF)平均(40.6±20.3) IU/L，血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)平均(41.5±19.8) mm/h，腫脹關(guān)節(jié)數(shù)平均(3.67±4.52)個(gè)，疼痛關(guān)節(jié)數(shù)平均(12.08±8.52)個(gè)。

2 OPG基因 163A/G及 245T/G 位點(diǎn)PCR擴(kuò)增結(jié)果及酶切結(jié)果

以外周血基因組DNA為模板，用合成的引物進(jìn)行OPG基因PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為300 bp，OPG163A/G位點(diǎn)在內(nèi)切酶AseI 的作用下分解為161 bp 和139 bp 2個(gè)片段，AA為純合子顯示2條帶(161 bp和139 bp)，GG為純合子僅1條帶(300 bp)，AG為雜合子顯示3條帶(300 bp、161 bp和139 bp)；245T/G位點(diǎn)在內(nèi)切酶HinfI 的作用下分解為245 bp 和55 bp 2個(gè)片段，GG為純合子(245 bp和55 bp)，TT為純合子(300 bp)，TG為雜合子(300 bp、245 bp和55 bp)。電泳圖中55 bp不顯影，見圖1、2。

Figure 1. PCR amplication result of 163A/G locus in OPG gene and the result of Ase I enzyme digestion.Lane 1: 163GG; Lane 2: 163AG; Lane 3: 163AA.

Figure 2. PCR amplication result of 245T/G locus in OPG gene and the result of Hinf I enzyme digestion.Lane 1: 245TT; Lane 2: 245TG; Lane 3: 245GG.

3 基因型和等位基因的分布

RA組OPG基因163A/G基因型頻率分別是AA 62.0%、AG 30.7%和GG 7.3%，野生型等位基因A 77.3%，突變型等位基因G 22.7%，對(duì)照組分別是AA 69.6%、AG 28.7%和GG 1.8%,等位基因分別為A 83.9%和G 16.1%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=6.993，P<0.05)。比較2組人群各基因型的分布，結(jié)果顯示GG基因型在2組有顯著差異(2=6.329，P<0.05)，AA基因型及AG基因型均未見顯著差異(分別為2=2.405及2=0.192，P>0.05)。245T/G在2組的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，分別為RA組TT 86.3%、TG 13.2%和GG 0.5%，對(duì)照組TT 84.2%、TG 14.6%和GG 1.2%。等位基因的比較亦未見顯著差異(P>0.05)，分別為RA組T 93.0%和G 7.0%,對(duì)照組T 91.5%和G 8.5%。這表明OPG基因163A/G單核苷酸多態(tài)性與我國(guó)漢族人群RA發(fā)病可能相關(guān)聯(lián)，但245T/G與發(fā)病無(wú)明顯相關(guān)性,見表1、2。

4 OPG 163A/G及 245T/G基因連鎖不平衡分析

根據(jù)連鎖不平衡分析，rs3102735和rs3134069存在不完全連鎖，LOD=1，R2=0.14。

5 163A/G及245T/G多態(tài)性與疾病的關(guān)聯(lián)性分析

建立多因素Logistic回歸模型，調(diào)整年齡、性別、病程、RF、ESR、hs-CRP和腫痛關(guān)節(jié)數(shù)后，OPG163G等位基因患RA的OR為1.219(95% CI：1.066～2.339，P<0.05),表明攜帶OPG163G基因型者患病危險(xiǎn)性是非攜帶者的1.219倍。245T/G未被納入回歸方程,表明與RA無(wú)明確關(guān)系。

表1 OPG 163A/G基因型在RA組和對(duì)照組中的分布

表2 OPG 245T/G基因型在RA組和對(duì)照組中的分布

討 論

RA發(fā)病機(jī)制紛繁復(fù)雜，涉及基因與環(huán)境多種因素，確切機(jī)制目前仍不完全清楚。針對(duì)RA發(fā)病機(jī)制中骨質(zhì)疏松以及骨與軟骨破壞的研究發(fā)現(xiàn)提示可能與OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)相關(guān)。而正常骨重建過(guò)程包括成骨細(xì)胞骨形成與破骨細(xì)胞骨吸收，兩者維持體內(nèi)骨代謝的動(dòng)態(tài)平衡。OPG/RANKL系統(tǒng)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化、成熟及病理狀態(tài)下的骨質(zhì)流失。在炎癥因子刺激下，RA關(guān)節(jié)周圍組織能表達(dá)RANKL，且能提供破骨細(xì)胞前體細(xì)胞。RANKL與表達(dá)于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞胞膜上的受體RANK結(jié)合，通過(guò)調(diào)控破骨細(xì)胞分化、成熟并抑制其凋亡，對(duì)RA骨質(zhì)溶解、軟骨破壞等過(guò)程發(fā)揮極為重要的調(diào)控作用，而OPG通過(guò)拮抗RANKL發(fā)揮作用[11]。

OPG是腫瘤壞死因子受體家族成員，人類OPG基因位于染色體8q23～24，OPG蛋白由401個(gè)氨基酸殘基組成，常以同二聚體形式分泌到胞外。OPG在人體的骨組織中有較高表達(dá)，主要由成骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌。在骨組織中，OPG作為一種誘餌受體，能與RANKL或腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，以阻斷RANKL與RANK結(jié)合，發(fā)揮抑制破骨細(xì)胞分化、成熟，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡的作用[12]。針對(duì)OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)在RA發(fā)病過(guò)程的候選基因關(guān)聯(lián)分析和全基因組SNPs掃描，被用來(lái)研究RA的遺傳學(xué)成因，發(fā)現(xiàn)了一些與RA相關(guān)的基因位點(diǎn)。這就更進(jìn)一步證實(shí)OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)與RA關(guān)系密切。

本研究選取的163A/G和245T/G位于OPG基因啟動(dòng)子區(qū)。通過(guò)病例-對(duì)照研究遺傳流行病學(xué)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，OPG163A/G基因型頻率和等位基因頻率2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但245T/G在2組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明OPG基因163A/G單核苷酸多態(tài)性與我國(guó)漢族人群RA發(fā)病相關(guān)，但245T/G與發(fā)病無(wú)明顯相關(guān)性。建立多因素回歸模型，調(diào)整其它調(diào)查因素年齡、性別、病程、RF、ESR、hs-CRP、腫痛關(guān)節(jié)數(shù)后，OPG163GG型患RA的OR為1.219，進(jìn)一步證明163A/G單核苷酸多態(tài)性與我國(guó)漢族人群RA發(fā)病相關(guān)。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)OPG多態(tài)性與RA相關(guān)性的研究報(bào)道。

Hussien等[13]在埃及人群中的調(diào)查認(rèn)為，OPG163A/G與RA易感性相關(guān)，并且與RA患者的骨質(zhì)疏松相關(guān)，是RA患者中骨質(zhì)疏松的重要參與因素。 相反的，Assmann等[14]在RA患者與健康對(duì)照者所做的病例對(duì)照研究中，對(duì)RANK、RANKL和OPG的7 個(gè)SNPs包括RANKrs1805034、rs35211496、OPGrs3102735、rs2073618以及RANKLrs9533156、rs2277438、rs1054016 進(jìn)行了分析，并未發(fā)現(xiàn)OPGrs3102735、rs2073618與RA相關(guān)。Furuya等[15]研究了RA患者OPG的2個(gè)SNPs rs2073617和rs2073618位點(diǎn)，未發(fā)現(xiàn)在日本人群中與RA的發(fā)病及影像學(xué)進(jìn)展有關(guān)聯(lián)。但Masi等[16]對(duì)癥狀出現(xiàn)1年以內(nèi)、影像學(xué)表現(xiàn)2年以內(nèi)的早期RA的研究表明，雖未發(fā)現(xiàn)RA與OPGRsaI限制性酶切多態(tài)性的相關(guān)性，但認(rèn)為此SNP與手影像學(xué)骨侵蝕相關(guān)。2013年，Guo等[17]對(duì)OPG相關(guān)文章做了薈萃分析，表明 A163G多態(tài)性與白種人骨質(zhì)疏松風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，而G1181C多態(tài)性的C等位基因則可降低骨質(zhì)疏松風(fēng)險(xiǎn)，尤其在亞洲絕經(jīng)后女性中更加明顯。

多項(xiàng)研究已經(jīng)表明OPG基因與骨密度相關(guān)。而針對(duì)OPGSNPs是否影響骨代謝更新和骨礦物質(zhì)密度，Choi等[ 18 ]的研究發(fā)現(xiàn)，OPGSNPs 163A/G與1181G/C與韓國(guó)女性絕經(jīng)后骨礦物質(zhì)密度降低有一定相關(guān)性，尤其是當(dāng)同時(shí)存在RANK575TT基因型時(shí)。Yu等[19]檢測(cè)了OPG基因18861A>G及25548C>T這2個(gè)SNPs，認(rèn)為18861A>G基因型與中國(guó)絕經(jīng)后婦女脊柱、股骨頸及全髖骨礦物質(zhì)密度降低相關(guān)，與骨質(zhì)疏松具有關(guān)聯(lián)性。Kim等[ 20 ]研究認(rèn)為OPGG1181C SNP單獨(dú)或與RANKLrs2277438 SNP同時(shí)存在可作為判斷韓國(guó)婦女腰椎骨礦物質(zhì)密度的重要相關(guān)遺傳因子。

由于目前國(guó)內(nèi)對(duì)于OPG/RANK/RANKL系統(tǒng) SNP與RA的研究尚不多見。本文對(duì)OPG基因與RA的關(guān)系進(jìn)行了初步探討。但由于研究人群數(shù)量有限，故進(jìn)一步的驗(yàn)證尚需多中心和大樣本的研究。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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