晏佩佩，潘曉燕，王紅荷，李質(zhì)馨，王雪楠，賴 勤，宋文靜，趙華一，竇肇華

1吉林醫(yī)藥學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，吉林132013

2濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，山東濟寧272029

雙酚A(bisphenol-A，BPA)是世界上使用最廣泛的工業(yè)化合物之一，主要用于生產(chǎn)環(huán)氧樹脂、聚砜樹脂、聚苯醚樹脂、不飽和聚酯樹脂等多種高分子材料。在日常生活中，從礦泉水瓶、醫(yī)療器械、食品包裝的內(nèi)里、罐頭內(nèi)包裝、嬰兒用瓶、牙科填充劑以及其他數(shù)百種日用品中都含有BPA［1］。BPA單體分子之間會發(fā)生聚合，以酯鍵結(jié)合在一起。當(dāng)這些聚合物在高溫下或與堿性/酸性物質(zhì)放在一起時，就會破壞BPA分子之間的酯鍵，使之發(fā)生斷裂，游離出BPA分子的單體。2003至2004年，美國健康和營養(yǎng)調(diào)查協(xié)會對6歲以上的不同年齡和性別的2 517名調(diào)查者進行了尿樣檢測，結(jié)果在92%以上人的尿樣中檢測到BPA，調(diào)查顯示由于工作原因接觸高濃度BPA的工人會出現(xiàn)男性性行為異常［2］。孕婦的胎盤［3］、臍帶血［4］和羊水［5］中也檢測到不同濃度的BPA。研究顯示妊娠期的動物接觸一定濃度的BPA，會顯著影響后代生殖器官的發(fā)育和機體自身的代謝功能［6］，胎兒或新生兒對接觸的BPA比成人更加敏感［7］。

BPA結(jié)構(gòu)類似于雌二醇和己烯雌酚，具有弱的雌激素活性，其在機體中發(fā)揮作用的方式與雌激素相似，主要通過與靶細胞上的雌激素受體結(jié)合調(diào)控細胞的功能。研究顯示BPA會影響到圍產(chǎn)期和植入期子宮的發(fā)育。Xiao等［8］對懷孕0.5～3.5 d的小鼠皮下注射100 mg/(kg·d)BPA，在懷孕4.5 d的子宮上未發(fā)現(xiàn)著床點，若將健康正常的胚胎移植到同劑量BPA處理的小鼠子宮，在4.5 d也未發(fā)現(xiàn)著床點，表明BPA改變了植入期子宮內(nèi)膜對胚胎的容受性。植入過程需要胚胎和子宮內(nèi)膜的同步發(fā)育，BPA影響了植入期子宮內(nèi)膜對胚胎的容受性，那么BPA是否也影響了植入前囊胚的發(fā)育，使囊胚失去了侵入子宮內(nèi)膜的能力，這方面的研究還較少。人們通過不同的給藥途徑發(fā)現(xiàn)BPA影響胚胎植入的濃度水平存在一定的爭議［8-9］，考慮到BPA進入人體的主要途徑是口服，因此本研究對孕鼠灌服不同濃度的BPA，以探討B(tài)PA對囊胚發(fā)育和囊胚植入的影響。

材料和方法

實驗動物 實驗用昆明種小白鼠90只，雌鼠體重30～35 g，雄鼠體重40～45 g，均購自長春高新技術(shù)實驗動物中心。飼養(yǎng)條件為溫度 (20±3)℃，濕度(50±10)%，自由攝食和飲水，室內(nèi)照明采用14∶10 h明暗交替。雄鼠均單籠飼養(yǎng)。

動物分組與處理 昆明小白鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，以雌雄1∶1合籠，次日晨檢查雌鼠陰道栓，發(fā)現(xiàn)陰道栓定為妊娠第0.5天。對妊娠鼠進行完全隨機化分組，分為100、300、600 mg/(kg·d)BPA組和對照組，將BPA處理組的孕鼠從妊娠的0.5～3.5 d，每天下午4∶00分別灌服100、300和600 mg/kg劑量的BPA(Sigma-Aldrich公司)，對照組灌服等量的豆油，連續(xù)灌服4 d。每組共做30只孕鼠。

著床點染色 妊娠第4.5天，利用水合氯醛對孕鼠進行麻醉，然后對麻醉好的孕鼠尾靜脈注射0.5%滂胺天藍 (Sigma-Aldrich公司)染液0.2 ml，待孕鼠口唇、眼睛變藍后，頸椎脫臼處死孕鼠，取出子宮，觀察子宮角上的藍染點，統(tǒng)計著床點數(shù)和著床率。著床率=有著床點的小鼠數(shù)/受精的小鼠數(shù)×100%。對于未染出著床點的見栓小鼠，PBS沖洗子宮角，發(fā)現(xiàn)胚胎的小鼠是受精的小鼠，未發(fā)現(xiàn)胚胎的小鼠則未發(fā)生受精。每組共做20只孕鼠。

獲取孕鼠的體內(nèi)胚胎 在妊娠的第4天，用PBS沖洗孕鼠的子宮角，獲取孕鼠體內(nèi)胚胎，觀察胚胎的發(fā)育情況，統(tǒng)計囊胚發(fā)育率和孵化率。囊胚率=囊胚數(shù)/總的胚胎數(shù)×100%;孵化率=孵化囊胚數(shù)/囊胚數(shù)×100%。將收集到的孵化囊胚用Hoechst 33342對細胞核進行染色，以統(tǒng)計孵化囊胚的總細胞數(shù)。每組共做10只孕鼠。

囊胚的免疫熒光染色 孵化囊胚在4%的多聚甲醛溶液中固定40 min，然后在0.1%Triton X-100的PBS溶液中作用15 min。將固定好的胚胎在活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3的一抗 (Abcam公司)(1∶400稀釋)中孵育2 h，PBS充分洗滌后，用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的二抗 (Invitrogen公司)(1∶400稀釋)作用1 h。利用1 μmol/L Hoechst 33342(Sigma-Aldrich公司)對囊胚卵裂球的細胞核DNA進行染色，胚胎封片，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，所有的圖片均在相同強度的激光照射下拍攝。

統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析 (One-Way ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

BPA對胚胎植入的影響 600 mg/(kg·d)BPA處理的孕鼠未觀察到著床點，但在子宮中沖出了胚胎，即高濃度的BPA抑制了胚胎的著床 (圖1)。300 mg/(kg·d)的BPA顯著降低了孕鼠的著床點數(shù)，且在300 mg/(kg·d)的BPA處理的12只孕鼠中，有6只未觀察到著床點。100 mg/(kg·d)BPA處理的16只孕鼠全都觀察到了著床點，且著床點數(shù)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (表1)。

BPA對第4天孕鼠子宮中囊胚發(fā)育和孵化的影響 BPA處理未影響囊胚的發(fā)育率 (表2)，但300和600 mg/(kg·d)BPA組囊胚的孵化率較對照組顯著降低 (P＜0.05)(表2)，能明顯地觀察到胚胎細胞外周完整的透明帶 (圖2)。高濃度的BPA影響了囊胚在子宮中的孵化。

BPA對囊胚孵化質(zhì)量的影響 對照組和不同濃度BPA處理組中孵化囊胚的總細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表3)，但300和600 mg/(kg·d)BPA組孵化囊胚中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3的陽性細胞數(shù)較對照組顯著增加 (圖3)。

表1 第4.5天孕鼠的著床點數(shù)和著床率Table 1 The number of implantation sites and the rate of implantation of mice on day 4.5 of pregnancy

圖1 第4.5天孕鼠的著床點染色 (滂胺天藍染色，×40)Fig 1 Staining of the implantation sites of mice on day 4.5 of pregnancy(pontamine sky blue staining， ×40)

圖2 第4天孕鼠子宮中的胚胎Fig 2 Embryos from the uteri of mice on day 4 of pregnancy

表2 第4天孕鼠子宮中囊胚發(fā)育率和孵化率Table 2 Blastocyst development rate and hatching rate on day 4 of pregnancy

表3 第4天孵化囊胚的總細胞數(shù)和凋亡細胞數(shù) (n)Table 3 Numbers of total cells and apoptotic cells of hatched blastocysts on day 4 of pregnancy(n)

圖3 孵化囊胚凋亡細胞的免疫熒光染色 (×800)Fig 3 Staining of the apoptotic cells of hatched blastocysts with the immunofluorescence technique(×800)

討 論

考慮到BPA可能對人體產(chǎn)生的不良影響，美國食品與藥品監(jiān)督管理局規(guī)定人類每天BPA的攝入耐受劑量為50 μg/(kg·d)。但動物實驗顯示在這樣的濃度下對機體會產(chǎn)生顯著的不良影響［7］，尤其是胎兒和新生兒對BPA的接觸比成年動物更加敏感。另外，由于個人生活習(xí)慣的不同，對塑料制品的加熱或反復(fù)使用，也會提高人體接觸BPA的濃度。目前，人們對于日常接觸到的BPA是否會對人體產(chǎn)生不良影響，會產(chǎn)生怎樣的不良影響正在研究中。

本研究探討孕鼠在胚胎著床時期接觸BPA可能會對囊胚發(fā)育和植入產(chǎn)生的不良影響。結(jié)果顯示高濃度的BPA顯著影響了囊胚的孵化，降低了囊胚的孵化質(zhì)量，以致囊胚的植入被抑制。有研究表明由于給藥途徑和給藥時間的不同，BPA影響胚胎植入的濃度范圍存在一定的差異［10］。本研究模擬人接觸BPA最廣泛的途徑，對目前廣泛使用的昆明種小鼠從妊娠后的0.5～3.5 d灌服不同濃度的BPA，結(jié)果顯示300 mg/(kg·d)BPA影響了胚胎植入，600 mg/(kg·d)BPA處理的孕鼠未觀察到著床點，抑制了胚胎的植入。而Xiao等［8］的研究表明皮下注射100 mg/(kg·d)BPA抑制了胚胎的植入，表明皮下注射的給藥途徑比經(jīng)口服消化后對胚胎著床的影響更敏感，但人類接觸BPA最廣泛的途徑是通過與一些食品包裝的內(nèi)里反復(fù)接觸，經(jīng)口服消化后產(chǎn)生的影響，因此本研究更能模擬人類接觸BPA產(chǎn)生的不良影響。不僅給藥途徑會影響機體對BPA的敏感性，不同妊娠時間給藥也會產(chǎn)生不同的效果。Berger等［11］研究顯示在妊娠的第 0.5天或第1.5天對孕鼠皮下注射10.125 mg BPA顯著降低了著床點數(shù)，而在妊娠的第2.5天注射相同劑量的BPA對胚胎的著床點數(shù)無影響，表明孕鼠妊娠后的0.5～1.5 d對內(nèi)分泌干擾劑比妊娠后2.5 d更加敏感。

BPA可通過干擾植入期子宮內(nèi)雌激素受體和孕激素受體的表達，影響子宮內(nèi)膜上皮細胞、子宮腺上皮細胞和子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞中與胚胎植入相關(guān)基因的表達和蛋白的分泌［12］，進而使子宮失去了接受胚胎植入的能力，導(dǎo)致植入失敗。植入前胚胎的發(fā)育是一個受激素調(diào)控的發(fā)育過程，具有類雌激素作用的BPA是否會影響植入前體內(nèi)胚胎的發(fā)育，這方面的研究較少。Takai等［13］在小鼠2-細胞胚胎的體外培養(yǎng)液中添加了100 μmol/L的BPA，培養(yǎng)48 h后顯著提高了胚胎的退化率。Lee等［14］將小鼠2-細胞胚胎在添加了不同濃度BPA的培養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h，結(jié)果顯示隨著BPA濃度的升高顯著降低了小鼠囊胚的發(fā)育率，10－4mol/L的BPA抑制了囊胚的發(fā)育，無胚胎發(fā)育到囊胚。從胚胎的體外實驗可以看出，BPA對植入前胚胎的發(fā)育會產(chǎn)生不良的影響。體內(nèi)胚胎與體外胚胎所處的生長發(fā)育的環(huán)境不同，植入前的胚胎處于子宮的內(nèi)環(huán)境中，受子宮內(nèi)環(huán)境中不同類型細胞的影響，子宮的內(nèi)環(huán)境是否會減輕BPA對體內(nèi)胚胎發(fā)育的影響尚不清楚。Lee等［14］將小鼠2-細胞胚胎與子宮內(nèi)膜上皮細胞共培養(yǎng)可顯著減輕BPA對胚胎發(fā)育的毒性作用，提高胚胎的體外發(fā)育率，表明子宮內(nèi)膜上皮細胞分泌的一些細胞因子可能對胚胎的發(fā)育具有保護作用。本研究觀察了BPA處理對孕鼠體內(nèi)囊胚的發(fā)育情況，結(jié)果顯示BPA對體內(nèi)囊胚發(fā)育的影響具有一定的濃度依賴性，300和600 mg/(kg·d)BPA顯著降低了囊胚的孵化率，而100 mg/(kg·d)BPA對囊胚發(fā)育率和孵化率無影響，表明子宮內(nèi)環(huán)境對胚胎發(fā)育的保護作用有一定范圍，如果干擾劑的濃度超過了這一范圍，即會對胚胎的體內(nèi)發(fā)育產(chǎn)生不良影響。

本研究比較了各組中孵化囊胚的總細胞數(shù)和凋亡細胞數(shù)，結(jié)果顯示各組中孵化囊胚的總細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但300和600 mg/(kg·d)BPA組孵化囊胚中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3陽性的細胞數(shù)較對照組顯著增加，高濃度的BPA影響了孵化囊胚的質(zhì)量。Jin等［15］對成年大鼠連續(xù)14 d口服2 μg/kg的BPA，顯著提高了睪丸生精細胞中凋亡細胞的數(shù)量，F(xiàn)as、FasL和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 mRNA水平也較對照組顯著升高，表明BPA可促進生殖細胞的凋亡。Tsutsui等［16］研究顯示BPA可與金黃地鼠胚胎細胞中的DNA形成DNA加合物，導(dǎo)致細胞染色體異倍性的發(fā)生。Pfeiffer等［17］用BPA處理V79細胞，未發(fā)現(xiàn)BPA誘導(dǎo)DNA斷裂。本研究通過Hoechst 33342對孵化囊胚的細胞核進行染色，也未發(fā)現(xiàn)DNA斷裂，BPA誘導(dǎo)了活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3蛋白的表達，使得表達活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3蛋白的細胞數(shù)顯著增加，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3蛋白作為細胞凋亡的執(zhí)行者會誘導(dǎo)細胞的凋亡，影響囊胚向子宮內(nèi)膜侵入。

綜上，高濃度BPA損傷了植入前囊胚的發(fā)育，提高了孵化囊胚中凋亡細胞的數(shù)量，影響了胚胎侵入子宮內(nèi)膜能力的獲得，進而抑制了胚胎的植入。進一步的研究是找出BPA在囊胚中直接或間接作用的靶分子，闡明這些靶分子對囊胚發(fā)育的影響以及BPA對這些靶分子的調(diào)控作用。

［1］ 晏佩佩，潘曉燕，王雪楠，等.雙酚A對雌性生殖器官的影響及作用機制 ［J］．中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，2013，35(6):683-688.

［2］ Li D，Zhou Z，Qing D，et al.Occupational exposure to bisphenol-A(BPA)and the risk of self-reported male sexual dysfunction ［J］．Hum Reprod，2010，25(2):519-527.

［3］ Schonfelder G，Wittfoht W，Hopp H，et al.Parent bisphenol A accumulation in the human maternal-fetal-placental unit［J］．Environ Health Perspect，2002，110(11):A703-A707.

［4］ Wan Y，Choi K，Kim S，et al.Hydroxylated polybrominated diphenyl ethers and bisphenol a in pregnant women and their matching fetuses:placental transfer and potential risks［J］．Environ Sci Technol，2010，44(13):5233-5239.

［5］ Yamada H，F(xiàn)uruta I，Kato EH，et al.Maternal serum and amniotic fluid bisphenol A concentrations in the early second trimester［J］．Reprod Toxicol，2002，16(6):735-739.

［6］ Suzuki A，Sugihara A，Uchida K，et al.Developmental effects of perinatal exposure to bisphenol-A and diethylstilbestrol on reproductive organs in female mice ［J］．Reprod Toxicol，2002，16(2):107-116.

［7］ Alonso-Magdalena P，Vieira E，Soriano SA，et al.Bisphenol a exposure during pregnancy disrupts glucose homeostasis in mothers and adult male offspring［J］．Environ Health Perspect，2010，118(9):1243-1250.

［8］ Xiao S，Diao H，Smith MA，et al.Preimplantation exposure to bisphenol A(BPA)affects embryo transport，preimplantation embryo development，and utetine receptivity in mice［J］．Reprod Toxicol，2011，32(4):434-441.

［9］ Andersen HR，Andersson AM，Arnold SF，et al.Comparison of short-term estrogenicity tests for identification of hormone-disrupting chemicals ［J］．Environ Health Perspect，1999，107(Suppl 1):89-108.

［10］ Berger RG，Hancock T，deCatanzaro D.Influence of oral and subcutaneous bisphenol-A on intrauterine implantation of fertilized ova in inseminated female mice［J］．Reprod Toxicol，2007，23(2):138-144.

［11］ Berger RG，Shaw J，decatanzaro D.Impact of acute bisphenol-A exposure upon intrauterine implantation of fertilized ova and urinary levels of progesterone and 17 beta-estradiol［J］．Reprod Toxicol，2008，26(2):94-99.

［12］ Varayoud J，Ramos JG，Bosquiazzo VL，et al.Neonatal exposure to bisphenol A alters rat uterine implantation-associated gene expression and reduces the number of implantation sites［J］．Endocrinology，2011，152(3):1101-1111.

［13］ Takai Y，Tsutsumi O，Ikezuki Y，et al.Preimplantation exposure to bisphenol A advances postnatal development［J］．Reprod Toxicol，2001，15(1):71-74.

［14］ Lee MS，Lee YS，Lee HH，et al.Human endometrial cell coculture reduces the endocrine disruptor toxicity on mouse embryo development［J］．J Occup Med Toxicol，2012，7(1):7.

［15］ Jin P，Wang X，Chang F，et al.Low dose bisphenol A impairs spermatogenesis by suppressing reproductive hormone production and promoting germ cell apoptosis in adult rats［J］．J Biomed Res，2013，27(2):135-144.

［16］ Tsutsui T，Tamura Y，Yagi E，et al.Bisphenol-A induces cellular transformation，aneuploidy and DNA adduct formation in cultured syrian hamster embryo cells［J］．Int J Cancer，1998，75(2):290-294.

［17］ Pfeiffer E，Rosenberg B，Deuschel S，et al.Interference with microtubules and induction of micronuclei in vitro by various bisphenols［J］．Mutat Res，1997，390(1-2):21-31.