張 博，劉 娜，顧 斌，吳 昊，高羽萱，王東勝，劉洪臣

中國人民解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所，北京100853

頜骨質(zhì)量是口腔種植成功的關(guān)鍵。糖尿病患者由于其成骨質(zhì)量不佳影響口腔種植的效果［1-2］。在骨愈合過程中間充質(zhì)干細胞的募集和增殖發(fā)揮著重要的作用［3-4］。已有研究證實高糖環(huán)境抑制成骨樣細胞MG-63和 MT373的增殖［5-6］，對于骨髓基質(zhì)細胞，Gopalakrishnan等［7］證實高糖環(huán)境干預(yù)骨髓基質(zhì)細胞的增殖。這些都表明高糖環(huán)境是影響骨髓基質(zhì)細胞增殖的重要原因，但其機制卻并不明確。Wnt/β-鏈蛋白信號通路是一條與細胞增殖密切相關(guān)的信號通路［8］，其下游的靶基因細胞周期蛋白D1可以促使細胞在增殖過程中從G1期向S期過度［9］，因此細胞周期蛋白D1的表達可以影響到細胞的增殖［10-11］。但高糖微環(huán)境影響細胞增殖的過程中是否有Wnt/β-鏈蛋白信號通路的參與，目前相關(guān)報道較少。本研究采用大鼠下頜骨來源的骨髓基質(zhì)細胞，觀察高糖對骨髓基質(zhì)細胞增殖的影響，并檢測高糖環(huán)境下Wnt/β-鏈蛋白信號通路中關(guān)鍵因子β-鏈蛋白、淋巴增強因子-1(lymphoid enhancer factor-1，LEF-1)以及下游靶基因細胞周期蛋白D1的變化，從而結(jié)合Wnt/β-鏈蛋白信號通路探討高糖微環(huán)境對骨髓基質(zhì)細胞增殖的影響。

材料和方法

材料 雄性Wistar大鼠10只，4周齡，由中國人民解放軍總醫(yī)院動物實驗中心提供;L-DMEM培養(yǎng)基(美國 Gibico公司)，胎牛血清 (美國 Invitrogen公司)，葡萄糖粉 (美國Sigma公司)，LEF-1、細胞周期蛋白D1、GAPDH引物 (深圳華大基因公司合成)，Anti-β-鏈蛋白、Anti-β-actin、Anti-細胞周期蛋白 D1、羊抗兔IgG(美國Abcam公司)，PrimeScriptTM實時定量多聚酶鏈反應(yīng)試劑盒、Premix Ex TaqTM試劑盒 (日本Takara公司);細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板 (美國Corning公司)，CO2恒溫培養(yǎng)箱 (美國 ThermoForma公司)，超凈工作臺 (北京長城空氣凈化設(shè)備工程公司)，純水機 (美國Millipore公司)，倒置相差顯微鏡 (德國Leica公司)，Centrifuge 5810R低溫離心機 (德國Eppendorf公司)，UsingiMarkTM酶聯(lián)免疫檢測儀 (美國Bio-Rad公司)，流式細胞儀 (美國Beckman-Coulter公司)，Bio-Rad IQ5 Real-Time PCR檢測系統(tǒng) (美國Bio-Rad公司)，全自動生化分析儀 (日本Hitachi公司)。

骨髓基質(zhì)細胞的體外培養(yǎng) 骨髓基質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)遵循本實驗室前期的實驗步驟［12］，取3～5代細胞進行實驗。

噻唑藍法檢測細胞增殖 將細胞密度調(diào)整為2×104個/ml接種于96孔板中，培養(yǎng)基分別為含生理葡萄糖濃度培養(yǎng)基 (5.5 mmol/L)和含高糖濃度培養(yǎng)基(16.5 mmol/L)。每組設(shè)3個重復(fù)孔，每隔2天換液。于1、3、5、7 d進行測試。測試時100 μl 5 g/L噻唑藍溶液被加到每孔中，5%CO2孵育4 h。然后，吸凈孔內(nèi)液體，加入500 μl二甲基亞砜溶解在細胞中形成晶體，振蕩器中震蕩15 min。酶聯(lián)免疫檢測儀在波長490 nm檢測吸光值。本實驗重復(fù)進行3次。

細胞周期檢測 將細胞常規(guī)培養(yǎng)5 d后消化，PBS沖洗兩遍，制備細胞懸濁液，將細胞濃度調(diào)整為5×105個/ml，PBS重懸細胞后加入預(yù)冷的70%的乙醇1.5 ml吹打均勻，4℃過夜，離心去乙醇，PBS沖洗兩遍，加入5 mol/L的碘化丙錠1 ml，4℃避光染色30 min，過200目尼龍篩網(wǎng)，流式細胞儀測定DNA含量，根據(jù)不同的DNA含量判斷細胞周期。計算細胞增殖指數(shù) (proliferation index，PI):PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

Western blot法檢測β-鏈蛋白表達 將骨髓基質(zhì)細胞以1×105個/ml接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，以不同糖濃度培養(yǎng)基 (5.5、16.5 mmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)5 d。棄去培養(yǎng)液，裂解細胞，提取蛋白，取等量蛋白經(jīng)8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉封閉過夜。加入兔抗大鼠β-鏈蛋白 (1∶1 000稀釋)、抗細胞周期蛋白 D1(1∶1 000稀釋)和β-actin(1∶2 000稀釋)，37 ℃孵育2 h，洗膜后，利用羊抗兔IgG(1∶4 000稀釋)孵育50 min，化學(xué)發(fā)光法顯示抗原抗體復(fù)合物，X線片顯影并定影，利用image J對條帶的相對灰度進行分析。以上實驗重復(fù)3次。

實時定量PCR檢測 將骨髓基質(zhì)細胞以1×105個/ml接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，以不同糖濃度培養(yǎng)基(5.5、16.5 mmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)5 d。利用Trizol提取RNA，紫外分光光度計定量RNA濃度 ［RNA濃度(μg/μl)=A260×40×稀釋倍數(shù)/1 000)］，A260/A280值判斷其純度，正常值在1.6～2.0。采用PrimeScriptTMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)試劑盒合成cDNA，合成引物見表1，定量PCR采用Takara公司的SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒，各組體系配置好后置于Bio-Rad IQ5熒光檢測儀上進行檢測。反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性10 s，1個循環(huán)，95℃變性5 s和60℃退火和延伸20 s，40個循環(huán)。mRNA的表達采用相對表達量進行比較，即目的基因相對于管家基因GAPDH的表達量所增加的倍數(shù)進行比較;采用2-ΔCt法計算各mRNA 的相對表達量［13］。

統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，其中兩兩間比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

圖1 不同糖濃度下骨髓基質(zhì)細胞的形態(tài)學(xué)變化 (×400)Fig 1 Morphological changes of bone marrow stromal stem cells on the different concentrations of glucose(×400)

圖2 噻唑藍法檢測結(jié)果Fig 2 Results of methyl thiazolyl tetrazolium assay

結(jié) 果

高糖干預(yù)后骨髓基質(zhì)細胞的形態(tài)學(xué)變化 取第4代細胞采用不同糖濃度培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，正常糖濃度 (5.5 mmol/L)培養(yǎng)細胞呈紡錘形，分布均勻，培養(yǎng)5 d后可覆蓋瓶底80%以上，而在高糖濃度下(16.5 mmol/L)細胞呈現(xiàn)多極性生長，邊緣常呈鈍角狀或瘤狀突起，且培養(yǎng)5 d后細胞密度低于正常糖濃度 (圖1)。

高糖環(huán)境對骨髓基質(zhì)細胞增殖的影響 噻唑藍法結(jié)果顯示在不同糖濃度 (5.5、16.5 mmol/L)的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)1 d時細胞的光密度 (optical density，OD)值差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P=0.700)，培養(yǎng)3、5、7 d時16.5 mmol/L組細胞的OD值顯著低于5.5 mmol/L組(P=0.006，P=0.002，P=0.003)(圖2)。細胞周期檢測結(jié)果顯示不同糖濃度培養(yǎng)5 d后，16.5 mmol/L組細胞的增殖指數(shù)顯著低于5.5 mmol/L組 (P=0.014)(表2)，同時高糖環(huán)境可以抑制細胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化。

高糖環(huán)境對骨髓基質(zhì)細胞β-鏈蛋白的影響 與5.5 mmol/L組細胞相比，16.5 mmol/L組細胞在培養(yǎng)5 d后β-鏈蛋白的分泌顯著降低 (P=0.001)(圖3)。

高糖環(huán)境對骨髓基質(zhì)細胞LEF-1、細胞周期蛋白D1 mRNA及細胞周期蛋白D1蛋白表達的影響 細胞在培養(yǎng)5 d后，16.5 mmol/L組細胞的LEF-1、細胞周期蛋白D1的mRNA的表達水平以及蛋白表達水平均顯著低于5.5 mmol/L組細胞 (P=0.000)(圖4、5)。

討 論

本研究利用高糖環(huán)境對從大鼠頜骨提取的骨髓基質(zhì)細胞進行干預(yù)，觀察高糖對骨髓基質(zhì)細胞增殖的影響，同時為確定高糖抑制細胞增殖的過程中是否有Wnt/β-鏈蛋白信號通路的參與，檢測了高糖環(huán)境下通路中關(guān)鍵因子β-鏈蛋白、LEF-1以及通路下游因子細胞周期蛋白D1的表達。

表2 流式細胞儀檢測細胞周期及增殖指數(shù) ( ± s，%)Table 2 Cell cycle and proliferation index by flow cytometry ± s，%)

表2 流式細胞儀檢測細胞周期及增殖指數(shù) ( ± s，%)Table 2 Cell cycle and proliferation index by flow cytometry ± s，%)

與5.5 mmol/L組比較，aP＜0.05aP＜0.05 compared with the 5.5 mmol/L group

分組G r o u p G 0/G 1期G 0/G 1 p h a s e S期S p h a s e G 2+M期G 2+M p h a s e增殖指數(shù)P r o l i f e r a t i o n i n d e x 5.5 m m o l/L 5 0.7 4±2.4 1 4 2.8 7±1.8 1 6.3 9±0.6 1 4 9.2 6±2.4 1 1 6.5 m m o l/L 5 9.7 8±2.8 4 a 3 1.7 6±1.9 7 a 8.4 6±0.8 8 4 0.2 2±2.8 4 a

圖3 不同糖濃度β-鏈蛋白的表達Fig 3 Expression of β-catenin on different concentrations of glucose

圖4 不同糖濃度LEF-1和細胞周期蛋白D1的mRNA表達Fig 4 mRNA expression of cyclin D1 and LEF-1 on different concentrations of glucose

圖5 不同糖濃度細胞周期蛋白D1的蛋白表達Fig 5 Protein expression of cyclin D1 on different concentrations of glucose

本研究噻唑藍法結(jié)果與細胞周期檢測結(jié)果均顯示高糖環(huán)境抑制了骨髓基質(zhì)細胞的增殖，這與前期學(xué)者實驗得出的結(jié)果［5-7］一致。細胞周期蛋白D1核編碼區(qū)通過細胞周期蛋白與CDK4結(jié)合，形成細胞周期蛋白D1/CDK4復(fù)合體，作用于其底物Rb蛋白，使得Rb蛋白磷酸化，導(dǎo)致細胞由G1向S期轉(zhuǎn)化。因此細胞周期D是細胞由G1期向S期轉(zhuǎn)換的重要限速因素，其表達可以直接影響到細胞的增殖［9-11］。本研究結(jié)果表明，高糖環(huán)境可以抑制細胞周期蛋白D1的表達，同時細胞周期的檢測結(jié)果表明高糖環(huán)境下可以影響骨髓基質(zhì)細胞由G1期向S期轉(zhuǎn)換，這與細胞周期蛋白D1已經(jīng)證實的生理功能相符。

Wnt/β-鏈蛋白信號通路可以影響細胞的增殖、分化、遷移等多種生理功能［14］。細胞周期蛋白 D1是Wnt/β-鏈蛋白信號通路下游的一個靶基因［15］，已經(jīng)證實高糖環(huán)境可以抑制細胞周期蛋白D1的表達，那么高糖環(huán)境是否會抑制Wnt/β-鏈蛋白信號通路?在經(jīng)典Wnt通路中，β-鏈蛋白發(fā)揮重要的作用，其可以與T細胞因子/LEF-1家族成員形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，從而促進下游目的基因的表達［16］。為了觀察高糖環(huán)境對Wnt/β-鏈蛋白信號通路的影響，本研究檢測高糖環(huán)境下β-鏈蛋白蛋白的表達以及LEF-1 mRNA的表達，結(jié)果表明在高糖的環(huán)境下，無論是β-鏈蛋白蛋白的表達還是LEF-1的mRNA的表達均受到了抑制，這與Wnt/β-鏈蛋白通路下游目的基因細胞周期蛋白D1的表達趨勢一致。因此本研究證實高糖環(huán)境可以影響Wnt/β-鏈蛋白通路，從而使其下游因子細胞周期蛋白D1下調(diào)。

綜上，高糖對細胞增殖的影響是一個復(fù)雜的過程，本研究初步證實高糖環(huán)境可以通過影響Wnt/β-鏈蛋白信號通路以及下游因子細胞周期蛋白D1的表達，從而抑制大鼠骨髓基質(zhì)細胞的增殖。

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