宋永硯，龔仁蓉，張 珍，李元昊，樊 梅，歐國進，方定志

1四川大學 華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，成都610041

2川北醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院生物化學教研室，四川南充637007

載脂蛋白A1(apolipoprotein A1，APOA1)是高密度脂蛋白 (high-density lipoprotein，HDL)的主要載脂蛋白，參與HDL的代謝調節(jié)。APOA1基因內的遺傳多態(tài)性對該基因的表達及血脂水平均有影響。APOA1基因內部含有多個變異位點，rs670(－75 G/A)多態(tài)性位點位于APOA1基因啟動子區(qū)域，研究顯示次要等位基因A與血漿APOA1［1-4］、高密度脂蛋白膽固醇 (high-densitylipoprotein cholesterol，HDLC)［3-7］、低密度脂蛋白膽固醇［8-9］和總膽固醇［8-9］水平升高相關聯(lián)。rs5069(+83C/T)多態(tài)性位于APOA1基因的第一內含子，研究顯示次要等位基因T與血漿APOA1［1，4，8］、HDL-C［4-6］和總膽固醇［8］水平升高相關聯(lián)。有關APOA1基因rs670和rs5069多態(tài)性對血脂水平的影響，以往研究絕大多數(shù)均在中老年人群中進行，較少有研究去探討這兩個變異位點對兒童和青少年血脂水平的影響。但是，脂代謝紊亂不僅是成年人心血管病的危險因素，它也以同樣的方式導致兒童和青少年血管內膜脂質條紋的形成和動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展［10］。因此，探討APOA1基因rs670和rs5069多態(tài)性對兒童和青少年血脂水平的影響對該人群心血管病的防治具有重要意義。

對象和方法

對象 選取四川省都江堰市中學生723人，其中女生407人、男生316人，年齡15～18歲，平均(16.86±0.59)歲。參試對象在納入前進行體檢并填寫健康調查問卷，排除有慢性消耗性疾病史或心腦血管疾病史的青少年，排除正在服用可影響糖脂代謝藥物以及激素類藥物的青少年。參試對象在納入前均簽署知情同意書。研究群體的甘油三酯 (triglycerides，TG)水平為(991.85±391.00)mg/L，總膽固醇(total cholesterol，TC)為(1 388.75 ±220.65)mg/L，低密度脂蛋白膽固醇水平為(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)為 (645.46±189.20)mg/L，HDL-C為(544.91±107.59)mg/L，血糖為(912.80±78.50)mg/L。

一般資料的收集 包括身高、體質量、腰圍、臀圍、血壓等。所有測量按常規(guī)方法進行。按體質量/身高2(kg/m2)計算體質量指數(shù)(body mass index，BMI)，按腰圍/臀圍計算腰臀比。

實驗分組 采用四分位數(shù)分組法對研究群體BMI進行分組，從小到大分為4組。各組人數(shù)及BMI水平分別為:1組180人，BMI(17.80±0.75)kg/m2;2組182人，BMI(19.39±0.32)kg/m2;3組181人，BMI(20.68±0.43)kg/m2;4組180人，BMI(23.40±2.05)kg/m2。

血脂及血糖測定 采血前24 h內限制高脂飲食，不飲酒，不做劇烈體力活動。于早上7點之前采集空腹靜脈血5 ml，分成兩份，一份用于制備血漿測定血脂濃度，另一份用于提取基因組DNA。血脂測定采用浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司的酶法測定試劑盒，具體操作嚴格按試劑盒說明書進行。所有指標測定重復3次。

APOA1 rs670和rs5069多態(tài)性分析

DNA提取:從外周血白細胞中提取基因組DNA，采用天根生化科技公司的血液基因組提取試劑盒進行提取，具體操作過程嚴格按試劑盒說明書進行。

PCR擴增:PCR擴增含有APOA1 rs670和rs5069多態(tài)性位點的DNA片段。引物序列由上海生物工程有限公司合成，正向引物為5’-AGGGACAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAG-3’，反向引物為 5’-TTAGGGGACACCTAGCCCTCAGGAAGAGCA-3’。PCR反應體系 (25 μl)中含有DNA模板1 μg，上游和下游引物各0.8 μmol/L，dNTP各200 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U。PCR擴增包括:95℃預變性5 min;95℃變性30 s，58℃退火40 s和72℃延伸40 s，共35次循環(huán);72℃延伸5 min。

限制性核酸內切酶分析:MspI酶切反應體系 (10 μl):1 μl 10 × 限制性內切酶緩沖液與 7 μl ddH2O充分混勻后，加入2 μl PCR擴增產(chǎn)物和5 U MspI內切酶。1 000 r/min瞬時離心30 s(轉子半徑為7.5 cm)，37℃水浴中酶切16 h。3%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)顯色鑒定各組樣本的基因型。

統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示。不符合正態(tài)分布的計量資料 (如TG)進行對數(shù)轉換后納入統(tǒng)計分析。采用 χ2檢驗比較BMI各組之間基因型及等位基因頻率的差異。采用One-way ANOVA檢驗比較BMI組內不同基因型之間計量資料的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 APOA1 rs670和rs5069多態(tài)性MspI酶切后的電泳圖譜Fig1 Electrophoresis map of the DNA fragments containing the rs670 and rs5069 polymorphism sites of APOA1 after digestion by MspI

結 果

APOA1 rs670和rs5069位點在研究群體中的基因型及等位基因頻率 rs670位點位于APOA1基因的啟動子區(qū)域，rs5069位點位于APOA1基因的第一內含子，對包含這兩個多態(tài)性位點的DNA區(qū)域進行PCR擴增，擴增片段總長度為434 bp。被擴增的DNA片段上含有3個MspⅠ酶切位點，包括兩個多態(tài)性位點(rs670位點和rs5069位點)和1個固有切點。rs670多態(tài)性由G(鳥嘌呤)變異成A(腺嘌呤)生成，G為主要等位基因，A為次要等位基因。G所在的核苷酸短序列可被限制酶MspⅠ識別和切割 (5’-C↓CGG-3’)，而A不能。酶切后的電泳圖譜上，GG基因型含有113和67 bp兩個片段，GA基因型含有180、113和67 bp 3個片段，AA基因型僅含180 bp的片段。rs5069多態(tài)性由C(胞嘧啶)變異成T(胸腺嘧啶)產(chǎn)生，C為主要等位基因，T為次要等位基因。C構成的核苷酸短序列可被限制酶MspⅠ識別和切割，而T不能。酶切后的電泳圖譜上，CC基因型含有209和45 bp兩個片段，CT基因型含有254、209和45 bp 3個片段，TT基因型僅含254 bp片段 (圖1)。

APOA1 rs670位點基因型頻率 (χ2=0.446，P=0.931)及等位基因頻率 (χ2=1.005，P=0.800)在BMI各組差異無統(tǒng)計學意義;APOA1 rs5069位點基因型頻率 (χ2=0.336，P=0.953)及等位基因頻率(χ2=0.405，P=0.939)在BMI各組差異亦無統(tǒng)計學意義 (表1)。

APOA1 rs670多態(tài)性對不同BMI青少年生理生化指標的影響 1、2和3組中所有指標在不同基因型青少年之間差異均無統(tǒng)計學意義。4組除A等位基因攜帶者的收縮壓 (P=0.017)和血糖水平 (P=0.009)顯著高于GG基因型參試者外，其他指標差異均無統(tǒng)計學意義 (表2)。

APOA1 rs5069多態(tài)性對不同BMI青少年生理生化指標的影響 1、2和3組中所有指標在不同基因型青少年之間差異均無統(tǒng)計學意義。4組中除T等位基因攜帶者的身高 (P=0.013)、體質量 (P=0.011)和臀圍 (P=0.026)顯著高于CC基因型參試者外，其他指標差異均無統(tǒng)計學意義 (表3)。

表2 不同BMI組中APOA1 rs670多態(tài)性不同基因型青少年生理生化指標的比較 ±s)Table 2 Physiological and biochemical indicaters of the adolescents with different APOA1 rs670 genotypes in the four different BMI groups±s)

表2 不同BMI組中APOA1 rs670多態(tài)性不同基因型青少年生理生化指標的比較 ±s)Table 2 Physiological and biochemical indicaters of the adolescents with different APOA1 rs670 genotypes in the four different BMI groups±s)

分組Group 年齡 (歲)Age(year)身高Height(cm)體質量Body mass(kg)BMI(kg/m2)腰圍Waist circumference(cm)臀圍Hip circumference(cm)腰臀比Waist to hip ratio收縮壓Systolic blood pressure(mmHg)1組Group 1 GG基因型參試者GG genotype(n=95)16.89±0.57 164.38±6.98 48.07±4.45 17.76±0.78 64.64±3.45 85.50±2.90 0.76±0.03 116.70±11.55 A等位基因攜帶者A carriers(n=85)16.81±0.57 163.05±7.47 47.53±4.53 17.84±0.71 64.56±3.54 85.69±3.06 0.75±0.03 118.29±12.11 P值P value 0.331 0.220 0.419 0.468 0.883 0.666 0.670 0.369 2組Group 2 GG基因型參試者GG genotype(n=102)16.97±0.62 163.83±8.10 52.28±5.25 19.43±0.31 67.72±3.14 88.63±3.12 0.76±0.03 120.41±11.72 A等位基因攜帶者A carriers(n=80)16.88±0.53 162.25±7.35 51.05±4.64 19.35±0.33 67.44±3.57 88.64±2.74 0.76±0.04 119.80±12.39 P值P value 0.276 0.176 0.101 0.120 0.571 0.977 0.576 0.734 3組Group 3 GG基因型參試者GG genotype(n=98)16.83±0.05 159.88±7.15 53.01±4.74 20.70±0.39 70.26±3.25 89.56±2.54 0.78±0.03 116.90±12.50 A等位基因攜帶者A carriers(n=83)16.83±0.05 160.77±8.48 53.50±5.51 20.65±0.45 70.78±3.70 90.00±3.16 0.78±0.03 118.68±11.32 P值P value 0.955 0.445 0.521 0.451 0.314 0.296 0.690 0.321 4組Group 4 GG基因型參試者GG genotype(n=96)16.80±0.60 158.80±7.63 59.06±8.08 23.34±1.98 76.37±6.66 93.70±4.74 0.81±0.04 117.39±10.72 A等位基因攜帶者A carriers(n=84)16.85±0.63 158.60±7.32 59.25±8.76 23.46±2.12 76.61±6.30 93.90±5.03 0.81±0.04 121.44±11.88 P值P value 0.641 0.855 0.885 0.687 0.808 0.787 0.8640.017

續(xù)表2

表3 不同BMI組中APOA1 rs5069多態(tài)性不同基因型青少年生理生化指標的比較 ±s)Table 3 Physiological and biochemical indicators of the adolescents with different APOA1 rs5069 genotypes in the four different BMI groups(±s)

表3 不同BMI組中APOA1 rs5069多態(tài)性不同基因型青少年生理生化指標的比較 ±s)Table 3 Physiological and biochemical indicators of the adolescents with different APOA1 rs5069 genotypes in the four different BMI groups(±s)

分組Group 年齡 (歲)Age(year)身高Height(cm)體質量Body mass(kg)BMI(kg/m2)腰圍Waist circumference(cm)臀圍Hip circumference(cm)腰臀比Waist to hip ratio收縮壓Systolic blood pressure(mmHg)1組Group 1 CC基因型參試者CC genotype(n=153)16.84±0.57 163.63±7.23 47.73±4.55 17.79±0.74 64.59±3.39 85.59±3.05 0.75±0.03 117.81±11.92 T等位基因攜帶者T carriers(n=27)16.96±0.51 164.42±7.30 48.28±4.14 17.84±0.79 64.69±4.03 85.58±2.52 0.75±0.03 115.40±11.15 P值P value 0.290 0.602 0.557 0.733 0.890 0.987 0.856 0.330 2組Group 2 CC基因型參試者CC genotype(n=158)16.93±0.60 163.10±8.12 51.73±5.23 19.40±0.32 67.66±3.44 88.65±3.04 0.76±0.04 120.26±12.25 T等位基因攜帶者T carriers(n=24)16.92±0.40 163.36±5.33 51.78±3.35 19.38±0.30 67.22±2.54 88.55±2.32 0.75±0.03 119.33±10.29 P值P value 0.915 0.880 0.965 0.853 0.552 0.876 0.6280.724

續(xù)表3

討 論

APOA1存在于HDL中，是HDL的主要載脂蛋白。HDL的主要功能是將外周膽固醇逆向轉運至肝，轉變成膽汁酸鹽排出體外。除了參與膽固醇逆向轉運外，HDL在體內還具有抗炎、抗氧化、抗栓塞等生理功能［11-12］。血漿膽固醇水平升高是心血管病的主要危險因素，HDL通過膽固醇逆向轉運而降低血漿膽固醇水平，因此具有抗動脈粥樣硬化的作用。研究顯示血漿HDL水平降低伴隨心血管病發(fā)病風險增高［13-14］。

APOA1的功能是激活卵磷脂－膽固醇酯酰轉移酶，卵磷脂－膽固醇酯酰轉移酶被激活后催化游離膽固醇酯化成膽固醇酯，膽固醇酯進入新生盤狀HDL內核，HDL逐漸成熟變成球狀顆粒。APOA1基因上含有多個遺傳變異位點，其中位于啟動子區(qū)的rs670位點和位于第一內含子的rs5069位點研究較多。研究顯示，APOA1 rs670和rs5069多態(tài)性與血漿APOA1、HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇和總膽固醇水平存在相關性，但報道結果不盡一致［1-9］。Wang等［6］在143例成年高加索人種中，發(fā)現(xiàn)rs670位點A等位基因和rs5069位點T等位基因均可顯著升高血漿HDL-C水平;在100例兒童高加索人種中，rs5069多態(tài)性與HDL-C水平具有顯著相關性，但rs670多態(tài)性與HDL-C水平無相關性。在歐洲的一項研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)無論在男性還是女性中，rs670位點A等位基因均可顯著升高APOA1和HDL-C的血漿水平，而且不受地理區(qū)域和語言的影響［3］。在我國漢族人群中，Zou等［4］研究顯示 rs670位點A等位基因和rs5069位點T等位基因可顯著升高血漿APOA1和HDL-C水平。在本研究的所有組別中，均未發(fā)現(xiàn)血漿脂質水平與APOA1 rs670和rs5069多態(tài)性存在相關性，這可能跟本研究群體的年齡結構特點有關。以往的相關研究絕大多數(shù)是在中老年人群中進行，而本研究的對象為青少年，年齡在15～18歲，平均 (16.86±0.59)歲。兒童和青少年的脂代謝較為穩(wěn)定，不易受遺傳變異的影響。

本研究rs670多態(tài)性不同基因型青少年的生理生化指標在1、2和3組中差異均無統(tǒng)計學意義，4組A等位基因攜帶者的血糖水平和收縮壓顯著高于GG基因型青少年。Chen等［15］研究顯示 APOA1 rs670多態(tài)性與收縮壓顯著相關，Logistic回歸分析顯示G等位基因是升高收縮壓的危險因素。但在另一項研究中，未發(fā)現(xiàn)APOA1 rs670多態(tài)性與血壓存在相關性［16］。本研究在BMI較高的青少年中，A等位基因攜帶者收縮壓顯著升高。APOA1 rs670多態(tài)性與血壓的相關性有待進一步闡明。本研究顯示在BMI較高的青少年中A等位基因攜帶者的血糖水平顯著高于GG基因型青少年。

rs5069多態(tài)性不同基因型青少年的生理生化指標在1、2和3組中差異均無統(tǒng)計學意義，4組T等位基因攜帶者的身高、體質量和臀圍顯著高于CC基因型青少年。Chen等［15］在2型糖尿病人群中發(fā)現(xiàn)rs5069多態(tài)性與BMI和腰臀比相關，C等位基因攜帶者BMI和腰臀比顯著升高。本研究在BMI較高的青少年中，T等位基因攜帶者的身高、體質量和臀圍顯著高于CC基因型青少年。rs5069位點存在于APOA1基因的第一內含子內，該多態(tài)性位點不是影響身高、體質量及臀圍等人體測量指標的功能性變異，很可能與其他影響人體測量指標的功能性變異連鎖不平衡。

綜上，在青少年群體中，APOA1 rs670多態(tài)性A等位基因與收縮壓和血糖水平升高相關聯(lián)，但這種關聯(lián)性僅在BMI較高的青少年中出現(xiàn)，具體機制尚有待于進一步研究。

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