林曉燕, 林秋平, 許昌聲, 寧若冰, 祝 江, 林金秀, 柴大軍△

(1福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院超聲影像科， 2福建省腫瘤醫(yī)院， 3福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心血管內科，福建省高血壓研究所，福建 福州 350005)

血脂代謝異常及血管壁的氧化應激損傷在動脈粥樣硬化 (atherosclerosis, AS) 的形成及斑塊進展過程中具有重要作用，是冠狀動脈粥樣硬化發(fā)生的主要病理基礎[1]。流行病學證實，低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein choleste-rol, LDL-C)、甘油三酯 (triglycerid, TG)和總膽固醇 (total choleste-rol, TC) 水平升高是導致血管壁脂質沉積并形成粥樣斑塊重要因素[2]。糖尿病是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的獨立危險因素，高糖誘導氧自由基水平升高，促使血管內皮氧化損傷，導致動脈粥樣硬化形成。血脂水平無明顯差異的糖尿病患者動脈粥樣硬化發(fā)生率顯著升高，糖尿病患者動脈粥樣硬化形成和發(fā)展與其高糖狀態(tài)下抗氧化能力下降，氧自由基增加導致血管內皮損傷有密切相關[3]。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate, NADPH) 氧化酶是血管內皮細胞活性氧簇 (reactive oxygen species, ROS) 的主要來源, 并參與了動脈粥樣硬化的病理生理過程，NADPH氧化酶的活化需要gp91phox亞基的參與[4-5]。

他汀類藥物作為膽固醇生物合成過程中限速酶3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA) 還原酶的抑制劑，已成為降脂治療的關鍵用藥。他汀通過降低血脂水平減少動脈脂質斑塊沉積，在改善動脈粥樣硬化的形成具有重要作用[6]。大量臨床和基礎研究發(fā)現(xiàn)，他汀的抗動脈粥樣硬化效應遠不局限于降脂作用，其降脂外效應也參與其中，如抗炎、抑制內皮細胞ROS生成、改善內皮細胞損傷等[7]。

類視黃醇X受體 (retinoid X receptor, RXR) 在核受體家族中具有獨特性，因其可與許多核受體形成異源二聚體在心血管功能的調控方面具有重要作用[8]。既往研究發(fā)現(xiàn)RXR可以通過與過氧化物酶體增殖物激活受體 (peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)及肝臟X 受體 (liver X receptor, LXR) 形成PPAR/RXR及LXR/RXR二聚體，改善小鼠血脂代謝水平[8]，RXR活性的增強可以顯著抑制高糖誘導的氧化應激反應對人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的損傷[9]。

阿托伐他汀及RXR激活均能改善血脂代謝、抑制氧化應激反應，降低動脈粥樣硬化的形成。我們推測二者發(fā)揮抗動脈粥樣硬化過程可能存在某種聯(lián)系。本研究將探討阿托伐他汀對鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導糖尿病高脂喂養(yǎng)載脂蛋白E敲除(apolipoprotein E knockout,ApoE-/-)小鼠動脈粥樣硬化的影響、機制及RXRα的介導效應。

材 料 和 方 法

1 材料和試劑

STZ、2’,7’-dichlorodihydro-fluoresceindiacetate(H2-DCFDA)和dihydroethidium (DHE)購自Sigma；ROS檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；小干擾RNA (siRNA) 轉染試劑盒(Trasspass R2 transfection reagent)購自New England BioLab；脂質體轉染試劑(X-treme GENE HP DNA transfection reagent)購自Roche；Protease Inhibitor Cocktail試劑盒購自Pierce；鼠抗人β-actin單克隆抗體、鼠抗人gp91phox多克隆抗體及HRP標記Ⅱ抗購自Abcam。

2 動物和分組

8周齡SPF級雄性ApoE-/-小鼠及SPF級C57BL/6小鼠體重(23±2) g，購于北京大學醫(yī)學部，均在相同的條件下飼養(yǎng)[恒溫(22±2) ℃，恒濕(55±5)%，人工光照明暗各12 h/d，24 h自由取食和飲水]。高脂飼料配方：膽固醇1%、脂肪5%、蛋黃粉5%、膽酸鈉0.1%，所有飼料由上海斯萊克公司提供。高脂喂養(yǎng)34只ApoE-/-小鼠隨機分為3組，其中2組ApoE-/-小鼠給予腹腔注射STZ(100 mg/kg)。實驗動物共分為4組：C57組8只；ApoE-/-組10只；STZ-ApoE-/-組12只；STZ-ApoE-/-+Atorv(10 mg·kg-1·d-1)組12只。將藥物溶于蒸餾水中，灌胃法給藥，每天1次，共3個月，非給藥組均用等量蒸餾水灌胃，每天1次。

3 STZ腹腔注射法構建糖尿病動物模型

STZ配制: 枸櫞酸緩沖液 (pH 4.4) 10 mL加100 mg STZ充分溶解(STZ濃度為10 g/L),于腹腔注射STZ前動物禁食12 h，注射量為0.1 mL/10g體重小鼠，注射STZ后給予自由飲水取食，3 d后測定小鼠空腹血糖，血糖水平達到11.2 mmol/L及以上小鼠用于實驗。

4 方法

4.1血清及胸主動脈勻漿ROS水平測定 摘取小鼠眼球取血，3 500 r/min 離心10 min，取血清于EP管中-80 ℃保存待測，血清檢測需生理鹽水稀釋5倍后進行。取胸主動脈段 (長度為0.5 cm)加0.5 mL生理鹽水于勻漿器中勻漿2 min，500 r/min離心5 min，取上清于EP管中-80 ℃保存待測。采用Fenton反應及Griess顯色測定血清及胸主動脈勻漿液ROS水平 (測量步驟根據(jù)說明書)，以每mL血清或勻漿上清液37 ℃ 1 min H2O2濃度下降 1 mmol/L為ROS 1 U。

4.2HE染色步驟 取約0.5 cm胸主動脈PBS沖洗，4%甲醛固定24 h，脫水石蠟包埋切片。常規(guī)HE染色，中性樹脂封片，血管內斑塊面積采用自動成像分析軟件系統(tǒng) (Olympus) 分析，每只動物取8張切片計算斑塊面積平均值。

4.3gp91phox蛋白表達檢測 小鼠胸主動脈總蛋白及細胞總蛋白抽提后備用。取15 μg蛋白提取液于10% SDS-PAGE電泳分離、轉膜，5%脫脂奶粉/TBST (10 mmol/L Tris·HCl, 150 mmol/L NaCl, 0.1% Tween, pH 7.2)室溫30 min，加gp91phox抗體(1∶500)4 ℃過夜，TBST漂洗3×5 min，加HRP標記Ⅱ抗(1∶2 000)，37 ℃孵育1.5 h，TBST漂洗3×5 min后曝光。gp91phox與β-actin蛋白吸光率值比值作為gp91phox相對含量。

4.4HUVECs的培養(yǎng) 參照Jaffe等[10]的方法。無菌條件下取新生兒臍帶約15 cm， PBS 沖洗臍靜脈2～3次；向臍靜脈內注入約10 mL 0.1% I型膠原酶，37 ℃、15～20 min，用M199 培養(yǎng)液沖洗3～4次，1 000 r/min離心10 min；棄上清，加入含20% FBS 的M199 培養(yǎng)基，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱24 h,更換培養(yǎng)基；鏡下觀察，待細胞長至80% ～ 90%匯合時行1∶2傳代，取3 ～5代細胞進行實驗。

4.5RXRαsiRNA和質粒轉染 用無菌雙蒸水稀釋合成的RXRαsiRNA (正義鏈5’-CCUUAUUUCUGUUACUACU-3’，反義鏈5’-AGUAGUAACAGAAAUAAGG-3’)及對照siRNA序列(scrambled) (正義鏈5’-UUGUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈5’-ACGUGACACGU-UCGGAGAATT-3’)，終濃度至50 μmol/L，取2.5 μL Trasspass R2 transfection solution A加到1.2 mL Opti-MEM中，混勻；將5 μL solution B加入A液體，混勻；吸取0.6 μLRXRαsiRNA加入上述稀釋液，混勻，室溫放置20 min；轉染前(HUVECs接種于6孔培養(yǎng)板，細胞生長至40%～60%匯合)更換無血清的Opti-MEM漂洗2次，加入轉染混合液，混勻；置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 h，每孔再加入1 mL含有10% FBS的Opti-MEM 24 h更換20% FBS的Opti-MEM培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中孵育進行后續(xù)干預。Western blotting檢測轉染后細胞內RXRα表達水平。

4.6流式細胞術檢測細胞內ROS水平 于待測細胞中加入H2-DCFDA (10 μmol/L)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱2 h，棄培養(yǎng)液，PBS漂洗細胞2次，加1 mL 0.1%胰酶-EDTA，迅速棄除，待細胞變圓并少量脫落加入完全培養(yǎng)液l.5 mL，反復吹打并制成細胞懸液， 1 000 r/min離心5 min，棄上清，每管內加入PBS 0.5 mL，重懸細胞，波長525 nm進行流式細胞術檢測，每次采用復管檢測，共進行3～4次獨立檢測計算均值進行統(tǒng)計學分析。

4.7NADPH氧化酶活性的測定 將待測細胞用預溫的PBS洗滌細胞2次，每孔(6孔板)加入1 mL PBS，刮下細胞制成細胞懸液，4 ℃、4 000×g離心5 min，棄上清，每管內加入100 μL預冷的PBS(含protease inhibitor cocktail)，快速凍融細胞4次， 12 000×g4 ℃離心10 min，取蛋白上清液待測；96孔不透光微孔板進行檢測，每孔內預加入含有1 mmol/L EGTA、150 mmol/L蔗糖、5 pmol/L lucigenin (電子接受體) 和100 μmol/L NADPH (反應底物)的磷酸鹽緩沖液，而后每孔加入50 μL蛋白上清液，Oriton Ⅱ冷光儀進行測定，每隔30 s測定1次樣本的光子發(fā)射量，連續(xù)測定30 min，計算均值， NADPH氧化酶活性表示方法為counts·min-1·ng-1蛋白，每次測定采用復管，重復3次。

5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)，采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0處理，多組間的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間比較使用最小顯著性差異(least significant difference，LSD)法檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 阿托伐他汀對STZ誘導的糖尿病ApoE-/-小鼠空腹血糖及血脂水平影響

ApoE-/-組與C57對照組空腹血糖水平無顯著差異。與ApoE-/-組相比，STZ-ApoE-/-組空腹血糖水平顯著增高 (P<0.01)。阿托伐他汀 (10 mg·kg-1·d-1) 治療對STZ誘導的糖尿病ApoE-/-小鼠空腹血糖水平無明顯影響，見表1。與C57組相比，ApoE-/-組血清TG、TC及LDL-C水平均顯著升高 (P<0.01)，HDL-C水平未見明顯改變； STZ-ApoE-/-組血清TC、LDL-C和HDL-C水平勻顯著高于ApoE-/-組，血清TG水平與ApoE-/-組相比無明顯差異；與STZ-ApoE-/-組相比，STZ-ApoE-/-+ Atorv組血清TG、TC、LDL-C和HDL-C水平無明顯差異,見表1。

表1 阿托伐他汀對STZ誘導糖尿病高脂飲食ApoE-/-小鼠的血脂、血糖水平的影響

2 阿托伐他汀對STZ誘導的糖尿病ApoE-/-小鼠血清及胸主動脈ROS水平的影響

ApoE-/-組小鼠血清及胸主動脈ROS水平顯著高于C57組，STZ誘導糖尿病后使ApoE-/-小鼠血清及胸主動脈ROS水平進一步升高；與STZ-ApoE-/-組相比，STZ-ApoE-/-+ Atorv組血清及胸主動脈ROS水平明顯降低 (P<0.05)，見表2。

表2 阿托伐他汀對STZ誘導糖尿病高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠血清及胸主動脈勻漿上清液ROS水平的影響

3 Western blotting觀察阿托伐他汀對STZ誘導的糖尿病ApoE-/-小鼠胸主動脈NADPH氧化酶亞基gp91phox蛋白水平的影響

與C57組小鼠相比，ApoE-/-組小鼠胸主動脈NADPH氧化酶亞基gp91phox蛋白水平顯著增加 (P<0.05)；STZ-ApoE-/-組小鼠胸主動脈gp91phox亞基的蛋白表達水平顯著高于ApoE-/-組(P<0.01)；阿托伐他汀顯著降低STZ-ApoE-/-小鼠胸主動脈gp91phox蛋白的表達(P<0.01)，見圖1。

Figure 1. The effects of atorvastatin on gp91phox expression in the thoracic aorta of STZ-induced diabetic ApoE-/- mice with fat-rich diet. 1: C57 group (n=8); 2: ApoE-/- group (n=10); 3: STZ-ApoE-/- group (n=12); 4: STZ-ApoE-/- +Atorv group (n=12).Mean±SD.**P<0.01 vs C57 group; #P<0.05 vs ApoE-/- group;△△P<0.01 vs STZ-ApoE-/- group.

4 阿托伐他汀對STZ誘導的ApoE-/-小鼠胸主動脈斑塊的影響

C57組小鼠胸主動脈內膜光滑，未見到脂質斑塊形成；ApoE-/-組小鼠可見內膜粗糙及小斑塊形成；STZ-ApoE-/-組小鼠血管內膜不規(guī)則并形成巨大斑塊，斑塊纖維帽薄，斑塊內有空泡形成，斑塊外層有一薄纖維層，斑塊面積顯著大于ApoE-/-組(P<0.01)；STZ-ApoE-/-+Atorv組胸主動脈脂質內膜只見小斑塊形成，斑塊內空腔小，可見到少量脂質，斑塊有一厚纖維層，斑塊面積明顯小于STZ-ApoE-/-組 (P<0.05)，見圖2。

5 siRNA轉染對RXRα表達的影響

與非干預組對比，RXRαsiRNA 12.5 nmol/L干預明顯下調內皮細胞RXRα表達，RXRαsiRNA 25 nmol/L干預使內皮細胞內RXRα表達進一步下調。RXRα質粒轉染增加內皮細胞RXRα表達，見圖3。

Figure 2. The effect of atorvastatin on plaque area of thoracic aorta in STZ-induced diabetic ApoE-/- mice with high-fat chow (HE staining,×40). 1: C57 group (n=8); 2: ApoE-/- group (n=10); 3: STZ-ApoE-/- group (n=12); 4: STZ-ApoE-/-+Atorv group (n=12).**P<0.01 vs C57 group；#P<0.05 vs ApoE-/- group；△P<0.05 vs STZ-ApoE-/- group.

6 阿托伐他汀抑制高糖環(huán)境下HUVECs NADPH氧化酶活性

與對照組相比，高糖組NADPH氧化酶活性明顯增加(P<0.05)；阿托伐他汀呈濃度 (10-8～10-6mol/L) 依賴性抑制高糖誘導的HUVECs中NADPH 氧化酶活性的增加，見圖4。

7 阿托伐他汀對高糖誘導的HUVECs中NADPH氧化酶亞基gp91phox表達的影響

與對照組相比，高糖組NADPH氧化酶亞基gp91phox表達水平顯著增加(P<0.05)，阿托伐他汀呈濃度 (10-8～10-6mol/L) 依賴性抑制高糖誘導的內皮細胞gp91phox表達；與高糖組相比，阿托伐他汀(10-6mol/L)gp91phox蛋白水平明顯降低(P<0.05)，見圖5。

Figure 3. The effects of RXRα siRNA (A) and RXRα plasmid (B) on RXRα expression. Mean±SD.n=4.. **P<0.01 vs control (without treatment)；#P<0.05 vs RXRα siRNA (12.5 nmol/L).

Figure 4. The effects of atorvastatin on NADHP activity in high glucose-treated HUVECs. Mean±SD. n=4.*P<0.05 vs control (without treatment); #P<0.05 vs glucose (25 mmol/L).

Figure 5. The effects of atorvastatin on gp91phox expression in high glucose-treated HUVECs.Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs control (without treatment); #P<0.05 vs glucose (25 mmol/L).

8 RXRα介導阿托伐他汀的抗氧化應激效應

將特異性的RXRα siRNA轉染進HUVECs之后，阿托伐他汀(10-6mol/L)對高糖環(huán)境下ROS生成及NADPH氧化酶活性的抑制作用顯著減弱(P<0.05)，HUVECs轉染RXRα質粒之后，高糖環(huán)境下阿托伐他汀對ROS及NADPH氧化酶活性抑制作用明顯加強(P<0.05)，見圖6。

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠出現(xiàn)血脂代謝異常，血清及胸主動脈ROS水平增加；鏈脲佐菌素誘導的糖尿病高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠血脂水平進一步升高，阿托伐他汀并沒有降低糖尿病高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠血脂、血糖水平，但可抑制血清及胸主動脈ROS水平，減少胸主動脈gp91phox表達，減輕胸主動脈脂質斑塊的形成，說明阿托伐他汀抗糖尿病高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠動脈硬化可能與其抑制高糖高脂引起的氧化應激有關。

動脈粥樣硬化不僅與血脂有關，與高糖引起的氧化應激也有關。Shen等[11]研究發(fā)現(xiàn)：即使血脂水平無差異，糖尿病患者冠狀動脈粥樣硬化程度仍顯著升高。糖尿病患者血糖升高通過激活多種信號途徑使內皮細胞內NADPH 氧化酶活化和ROS生成增加, 從而對血管內皮細胞產生氧化應激損傷導致內皮細胞功能障礙, 這是糖尿病促進動脈粥樣硬化等心血管并發(fā)癥形成和發(fā)展的重要機制[12]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)在人血管內皮細胞中，gp91phox是NADPH 氧化酶的重要亞基, 高糖環(huán)境下內皮細胞內gp91phox的表達水平顯著上調，通過轉染gp91phox特異性反義寡核苷酸降低gp91phox的表達后, 高糖環(huán)境下細胞內ROS的生成顯著減少[10]。在本研究中，我們觀察到糖尿病高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠胸主動脈斑塊面積明顯高于單純高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠，ApoE-/-小鼠和STZ誘導的糖尿病ApoE-/-小鼠的胸主動脈組織中gp91phox表達明顯增高，血清及胸主動脈ROS水平也顯著增加，因此糖尿病增加血脂異常狀態(tài)下的氧化應激作用可能是促進動脈粥樣硬化的重要原因。

Figure 6. Atorvastatin reduced high glucose-induced ROS production (A) and NADHP activity (B) via RXRα.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control (without treatment); #P<0.05 vs glucose (25 mmol/L); △P<0.05 vs glucose+atorvastatin+scrambled; ▲P<0.05 vs glucose+atorvastatin+liposome.

動脈內皮細胞的損傷是脂質沉積和粥樣斑塊形成的始動因素，冠狀動脈脂質斑塊與內皮功能障礙密切相關[13]。Jiang等[14]發(fā)現(xiàn)氧化應激反應可引起內皮損傷，在高脂條件下動脈粥樣硬化發(fā)生率顯著增加。本研究觀察到高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠血脂顯著升高，ROS水平也顯著增加，說明高脂血癥可增加氧化應激反應。阿托伐他汀可顯著下調糖尿病ApoE-/-小鼠胸主動脈gp91phox的表達，減少血清及胸主動脈組織內ROS的產生，抑制氧化應激反應，不僅與我們前期體外實驗結果一致，而且在不影響血糖水平、改善血脂代謝的情況下產生了明顯的抗動脈粥樣硬化作用。在體證實了阿托伐他汀可以通過下調高糖環(huán)境下的NADPH氧化酶gp91phox亞基的表達，抑制氧化應激反應，進而可能通過減少內皮細胞損傷，抑制動脈粥樣硬化產生，并且這一抗動脈粥樣硬化效應不依賴于血脂水平改變。阿托伐他汀10 mg·kg-1·d-1干預沒有產生降血脂作用考慮與他汀劑量偏小及動物持續(xù)進食高脂食物有關。

體外細胞研究觀察到，高糖環(huán)境下人臍靜脈內皮細胞內ROS顯著增加，NADPH氧化酶活性及NADPH氧化酶gp91phox亞基表達均明顯升高；通過流式細胞術和熒光顯微鏡技術，我們發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀能抑制高濃度葡萄糖刺激的ROS水平，弱化高糖誘導下內皮細胞產生的氧化應激反應。NADPH氧化酶在人血管內皮細胞受高濃度葡萄糖刺激產生ROS的過程中發(fā)揮了重要作用，NADPH氧化酶發(fā)揮作用有賴于其在胞漿中的催化亞基gp91phox水平[15]。體外細胞實驗又觀察到阿托伐他汀抑制高糖誘導NADPH氧化酶gp91phox亞基表達，降低NADPH氧化酶活性，也說明阿托伐他汀抑制高糖條件下氧化應激是通過降低NADPH氧化酶gp91phox亞基水平從而降低NADPH氧化酶活性。我們前期研究發(fā)現(xiàn)了RXRα可以抑制高糖對血管內皮的氧化應激損傷作用[16]；本研究中也觀察到RXRα siRNA干擾后，阿托伐他汀抗高糖氧化應激作用減弱，RXRα質粒轉染后，阿托伐他汀抗氧化應激加強，說明RXRα受體可調節(jié)阿托伐他汀抗氧化應激作用，因此推測阿托他汀保護內皮細胞氧化應激損傷可能是通過RXRα實現(xiàn)，從而起到抗動脈粥樣硬化作用。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可以在不改變STZ誘導的ApoE-/-小鼠血脂代謝情況下抑制動脈粥樣硬化斑塊形成。這一過程可能是通過下調NADPH氧化酶亞基gp91phox表達，降低NADPH氧化酶活性，抑制高脂喂養(yǎng)糖尿病APOE小鼠ROS水平，而產生抗動脈粥樣硬化作用，且這種作用可能是通過核受體RXRα介導的保護內皮細胞氧化應激損傷實現(xiàn)的。

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