齊 玲， 徐俊杰， 趙東海， 韓 磊， 紀朋艷， 王瑋瑤， 呂士杰

(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林132013)

多肽是由10～100個氨基酸分子經(jīng)脫水縮合而成的化合物，它在生物界中的存在十分廣泛。多肽除了具有營養(yǎng)、調(diào)節(jié)機體的代謝和生理功能外[1-2]，還可以作為藥物來發(fā)揮作用。多肽藥物具有活性高、用量小和易產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)點，現(xiàn)已成為藥物研發(fā)的熱點之一。西蘭花是具有明確抗癌特性的食物，它因含有多種營養(yǎng)成分而被稱為“營養(yǎng)素的寶庫”。研究表明，西蘭花中的維生素、多酚類和黃酮類物質(zhì)具有明確的抗氧化活性，硫代葡萄糖苷則能降低癌癥的患病風(fēng)險[3-4]，而硫苷的水解產(chǎn)物異硫氰酸鹽具有明確的抗癌作用[5]，但關(guān)于西蘭花多肽成分抗癌的研究較少。本實驗在以往工作的基礎(chǔ)上，將西蘭花多肽提取物經(jīng)凝膠過濾層析分離獲得4個主要洗脫峰，取其中第II峰即西蘭花多肽組分II(CII)多肽含量最高的洗脫物用于后續(xù)實驗研究[6]。本實驗進一步研究西蘭花中多肽組分II對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用及可能的機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細胞株 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤SHG-44細胞株，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供。

1.2主要試劑 RPMI-1640細胞培養(yǎng)基 (HyClone)；0.25%胰蛋白酶和小牛血清(Gibco)；四甲基偶氮唑(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)(Sigma)；西蘭花多肽組分II(凍干粉，吉林醫(yī)藥學(xué)院制備)；免疫組化試劑盒(北京中杉公司)；β-actin、Bax、Bcl-2和caspase-3 抗體(Santa Cruz)。

1.3主要儀器 CB150型CO2培養(yǎng)箱(Binder);J-26XP型超低溫高速離心機(貝克曼)；MDF-U53V型超低溫冰箱(三洋)；PLUS 384型全自動酶標儀(MDC)；IX-70型倒置顯微鏡(Olympus)；DNA蛋白電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)；Image-Pro Plus 圖像分析管理系統(tǒng) (Media Cybernetics)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) 預(yù)熱含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。從液氮罐中取出神經(jīng)膠質(zhì)瘤SHG-44細胞株，迅速置于37 ℃水浴振蕩至融化，離心后棄上清，將細胞用1 mL培養(yǎng)液輕輕混勻，將含細胞的培養(yǎng)液吸出后放入培養(yǎng)瓶中，再加入9 mL新鮮的培養(yǎng)液，輕輕混勻后置入5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，飽和濕度下進行培養(yǎng)。待細胞密度達80%～90% 匯合時，按1∶2進行傳代。

2.2MTT分析細胞活性 取適量西蘭花多肽組分II，將其配制成終濃度分別為3、10、30和100 mg/L的含藥培養(yǎng)液?；A(chǔ)培養(yǎng)液為含5%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。將SHG-44細胞消化后，以8×103cells/well的密度均勻種于96孔板中，置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。在24 h、48 h和72 h時分別加入含藥和不含藥的培養(yǎng)液，每個濃度重復(fù)5次。作用結(jié)束時，每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h終止培養(yǎng)，棄上清后，每孔加入150 μL DMSO，15 min后在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm波長處測定各孔吸光度(A)，以時間為橫坐標，A值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

2.3細胞凋亡率的檢測 將SHG-44細胞按每孔2×105細胞接種于6 孔板，4個實驗組均加入西蘭花多肽組分II，使其終濃度分別為3、10、30和100 mg/L，空白對照組加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，收集細胞，PBS 洗滌2 次。按照說明書操作，用1∶4 binding buffer 緩沖液190μL 重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為(2～5)×108/L，然后加入FITC標記的Annexin V-FITC 5 μL和20 mg/L PI 10 μL，冰浴10 min，流式細胞術(shù)檢測每個樣品中每10 000個細胞中細胞的凋亡率。

2.4細胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察 將SHG-44細胞以5 000 cells/well的密度接種于24孔板中培養(yǎng)過夜，次日加入西蘭花多肽組分II(3、10、30和100 mg/L)，設(shè)空白對照組，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，取出培養(yǎng)板后在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

2.5免疫細胞化學(xué)法檢測凋亡相關(guān)蛋白 將SHG-44細胞按5 000 cells/well的密度接種于置有玻片的24孔板中，實驗設(shè)空白對照組和西蘭花多肽組分II(3、10、30和100 mg/L)組，均作用72 h，玻片固定，滅活封閉，Ⅰ抗過夜，Ⅱ抗室溫孵育2 h，DAB顯色，脫水和透明后封片。每組各取3張切片，隨機選擇3個不同視野，應(yīng)用Image-Pro Plus分析軟件分析蛋白陽性產(chǎn)物的積分吸光度值，取平均值做統(tǒng)計分析。

2.6Western blotting法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達 將SHG-44細胞以1×108/L密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中。分別加入西蘭花多肽組分II，使其終濃度為3、10、30和100 mg/L，空白對照組加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，均作用72 h。收集細胞，PBS洗滌細胞后用50 μL細胞裂解液裂解細胞。提取蛋白后測定濃度，SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜封閉，加入β-actin、Bcl-2、Bax和caspase-3 抗體，4 ℃孵育過夜。Ⅱ抗室溫孵育1 h，膠片曝光拍照。實驗結(jié)果采用Image-Pro Plus圖像分析軟件進行分析，以特異性條帶平均吸光度與面積的乘積來反映蛋白的表達水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 西蘭花多肽組分II對SHG-44細胞活性的影響

MTT結(jié)果顯示，24 h時，100 mg/L 西蘭花多肽組分II組SHG-44細胞活性降低(P<0.05)；48h時，10、30和100 mg/L西蘭花多肽組分II組SHG-44細胞活性均降低(P<0.05)；72 h時，西蘭花多肽組分II各濃度組SHG-44細胞活性均下降(P<0.01)。并且，西蘭花多肽組分II對細胞活性的影響呈現(xiàn)時間-劑量效應(yīng)關(guān)系，見圖1。根據(jù)MTT結(jié)果，不同濃度的西蘭花多肽組分II作用SHG-44細胞后72 h時作用最為明顯，因此選取72 h作為后續(xù)實驗的時間。

2 SHG-44細胞凋亡率的變化

3、10、30和100 mg/L西蘭花多肽組分II 作用于SHG-44細胞72 h后，Annexin V/PI分析各用藥組凋亡率分別為(15.34±2.48)%、(19.64±3.35)%、(40.38±5.29)%和(63.21±3.17)%，各組凋亡率均明顯高于同期空白對照組(1.81±0.74)%，30和100 mg/L組較對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0. 05)，各用藥組的凋亡率隨著藥物劑量的增加而顯著升高，見圖2。

Figure 1. Effect of component Ⅱ (CⅡ) of broccoli polypeptide on the viability of SHG-44 cells. Mean±SD. n=5.*P<0.05,**P<0.01 vs 0 mg/L.

Figure 2. Effects of component II (CⅡ) of broccoli polypeptide on apoptosis of SHG-44 glioma cells.

3 SHG-44細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化

倒置顯微鏡下觀察，西蘭花多肽組分II(0、3、10、30和100 mg/L)作用于SHG-44細胞72 h后，對照組生長良好，各用藥組隨濃度升高細胞數(shù)量明顯減少，以100 mg/L西蘭花多肽組分II組最為明顯，鏡下可見到明顯的凋亡小體，見圖3。

Figure 3. Apoptotic morphology of SHG-44 cells was observed after treated with component II of broccoli polypeptide (×200).A: control group; B: 100 mg/L group.

4 SHG-44細胞凋亡相關(guān)蛋白的變化

免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示，3、10、30和100 mg/L西蘭花多肽組分II作用于SHG-44細胞72 h后，細胞Bax蛋白表達逐漸增加，Bcl-2蛋白表達逐漸減少，與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；計算Bax/Bcl-2的比值發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度升高，Bax/Bcl-2比值明顯升高，與空白對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

Figure 4. Expression of Bax and Bcl-2 proteins in SHG-44 cells after treated with component Ⅱ (CⅡ) of broccoli polypeptide (×200). Mean±SD. n=3.##P<0.01 vs 0 mg/L.

Western blotting結(jié)果顯示：3、10、30和100 mg/L西蘭花多肽組分II作用于SHG-44細胞72 h后，細胞表達Bax蛋白呈上升趨勢，與空白對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；細胞表達Bcl-2蛋白減少，與對照組比較，各藥物組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。檢測細胞caspase-3蛋白表達發(fā)現(xiàn)，各藥物組細胞表達量均增加，與空白對照組比較，30和100 mg/L西蘭花多肽組分II組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。計算Bax/Bcl-2比值發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，各藥物組比值均明顯增加(P<0.05或P<0.01)，見圖5。

討 論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)腫瘤的最常見類型，它具有發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、死亡率高而治愈率低的“三高一低”的特點。由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生于顱內(nèi)，它對人的生命和健康的威脅極大[6]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤一經(jīng)診斷，首選手術(shù)療法，術(shù)后再盡早輔以放、化療或聯(lián)合替莫唑胺等療法。結(jié)合手術(shù)和放化療方法，患者的中位生存率也僅達14.6個月[7]。因此，如何延長神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存時間，提高患者的生存質(zhì)量是目前膠質(zhì)瘤治療的難點。有研究發(fā)現(xiàn)，惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞由于激活了細胞的生長途徑和/或抑制細胞的凋亡途徑而對治療產(chǎn)生抵抗[8]。

多肽分為人工合成多肽和生物活性多肽兩種，它具有多種用途，可以應(yīng)用于多個領(lǐng)域，因此，開發(fā)多肽產(chǎn)品具有廣泛的市場前景。西蘭花是著名的抗癌食物之一，在此前研究中，本實驗組提取西蘭花多肽成分，得到4個組分，其中以組分Ⅱ的生物活性最高[9]，并發(fā)現(xiàn)其可以抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖。本研究進一步研究西蘭花多肽組分II在不同劑量時對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的作用，發(fā)現(xiàn)西蘭花多肽組分II作用SHG-44細胞24 h、48 h 和72 h均可以明顯地降低細胞活力，72 h時細胞活性降低最為明顯。以上結(jié)果說明，西蘭花多肽組分II作用不同膠質(zhì)瘤細胞后隨著作用時間及劑量的增加，細胞活性降低更加明顯，藥物作用具有時間-劑量效應(yīng)關(guān)系。

腫瘤細胞的生長受抑制可能是由于細胞凋亡或增殖受抑制所引起。因此，我們應(yīng)用Annexin V/PI 檢測細胞的凋亡率結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3、10、30和100 mg/L西蘭花多肽組分II均可以誘導(dǎo)SHG-44細胞發(fā)生凋亡，并且隨著劑量的增加，凋亡率亦明顯增加。進一步觀察SHG-44細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化發(fā)現(xiàn)，西蘭花多肽組分II作用于SHG-44細胞后，細胞密度隨藥物濃度升高而明顯減少，并可見到明顯的凋亡小體，100 mg/L西蘭花多肽組分II濃度組最多。以上結(jié)果說明，西蘭花多肽組分II在作用細胞后可以通過誘導(dǎo)細胞凋亡而抑制腫瘤細胞的生長，作用具有劑量依賴性。

在藥物促使細胞發(fā)生凋亡過程中，凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達的量和兩者比值往往決定了細胞是否容易發(fā)生凋亡。Bax是最常見的促凋亡相關(guān)蛋白之一，細胞在受到凋亡因子刺激時，Bax等會在線粒體膜上進行同源寡聚，使線粒體膜上的大孔通道開放，從而使細胞色素C等線粒體蛋白釋放到胞質(zhì)中，促使凋亡發(fā)生[10-12]。本實驗中免疫細胞化學(xué)和Western blotting方法結(jié)果顯示細胞表達Bax蛋白逐漸增加，表達Bcl-2蛋白逐漸減少，并且隨著藥物濃度升高，Bax/Bcl-2比值明顯升高(P<0.01)。以上結(jié)果表明，西蘭花多肽組分II可以促進凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，使Bax/Bcl-2比值增加。

Caspase-3是凋亡途徑下游主要的效應(yīng)因子，是凋亡的具體執(zhí)行者。當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時，caspase-3活性片段表達量會增加[13-14]。Western blotting檢測caspase-3蛋白的表達顯示，各用藥組細胞caspase-3蛋白活性片段表達量均增加，尤其是30和100 mg/L西蘭花多肽組分II組作用明顯(P<0.01)。這一結(jié)果表明，西蘭花多肽組分II促進SHG-44細胞caspase-3蛋白的活化，使凋亡得以發(fā)生。

總之，西蘭花多肽組分II通過促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞凋亡而抑制腫瘤細胞的生長，這可能是通過藥物作用后，促進腫瘤細胞促凋亡蛋白Bax和抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，使Bax/Bcl-2比值明顯增加，再通過線粒體途徑的激活使caspase-3蛋白活化增加，進而促進腫瘤細胞凋亡。但更深一步的機制，還需在今后的實驗中繼續(xù)研究。

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