王林洋，王成祥，李 杰

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700)

本課題在借鑒國內(nèi)外對氨溴索(ambroxol)研究方法的基礎(chǔ)上[1-3]，以西藥氨溴索和中藥化痰方二陳湯為對照，觀察以清熱化痰法指導(dǎo)下的蔞芩止嗽煎對AECOPD痰熱證大鼠肺組織、血清及灌洗液中青霉素藥物濃度的影響，即對抗生素增效作用的影響。

1 實驗材料

Wistar雄性大鼠130只，體質(zhì)量(200±20) g，合格證號SCXK(京)2009-0007，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。內(nèi)毒素(L2880,由美國Sigma-Aldrich公司提供)；青霉素(華北制藥有限公司生產(chǎn))；金黃色葡萄球菌(北京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)病原學(xué)與免疫實驗室提供)；哈德門香煙(焦油含量12 mg，煙堿含量1.2 mg，由上海卷煙廠生產(chǎn))；氨溴索(上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司)；甲醇、乙腈、正己烷(色譜純，美國Fisher Scientific公司)；乙酸(分析純，美國Fisher Scientific公司)；青霉素G標準品(純度≥99%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)；5 mol/L氫氧化鈉；0.15 mol/L磷酸二氫鈉水溶液。二陳湯方和蔞芩止嗽煎制備成免煎顆粒，由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供。Agilent 1290高效液相色譜儀、Agilent 6490串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)，渦旋混合儀(Scientific Industries公司)，KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，Avanti J-26 XPI離心機(Beckman Coulter公司)，Sigma 2-16 KL臺式冷凍離心機(德國Sigma公司)，Milli-Q超純水處理系統(tǒng)(美國Millipore公司)；分析天平(梅特勒AG245，最小精度0.1 mg)；Oasis RHLB 30 μm固相萃取小柱(6 cc/150 mg，3 cc/60 mg，美國Waters公司)，0.2 μm GHP濾膜(美國PALL公司)。

2 實驗方法

2.1 造模、分組及用藥 用熏吸香煙加氣管內(nèi)注射內(nèi)毒素的方法[4]建立大鼠COPD模型,分別于實驗第7、14、28天向氣管內(nèi)注入溶于注射用生理鹽水的內(nèi)毒素200 μL(1 g/L)。第1～28天(第7、14、28天除外)上午將大鼠置入自制密閉的有機玻璃倉(30 cm×45 cm×50 cm)內(nèi)，注入濃度約5%(V/V)哈德門香煙煙霧30 min/d，制備COPD大鼠模型。在COPD模型基礎(chǔ)上，參照李建生[5]AECOPD痰熱證模型建立方法，于第29天開始連續(xù)9 d置于溫度(38±1) ℃、相對濕度50%、風(fēng)速0.7 m/s的鼓風(fēng)干燥箱中進行風(fēng)熱刺激，2次/d，每次30 min，建立痰熱證模型,并于第38天經(jīng)鼻腔注入金黃色葡萄球菌2.4×109cfu/mL)，2次/d，每次0.3 mL，連續(xù)滴注細菌3 d，制備AECOPD大鼠模型。模型制備后大鼠隨機分成4組，即對照組、氨溴索組、二陳湯組和蔞芩止嗽煎組，每組各20只。每組分別予股四頭肌肌內(nèi)注射青霉素16萬u/(kg·d)(與人體肌注量等效)，連續(xù)7 d；同時對照組予蒸餾水10 mL/(kg·d)灌胃，氨溴索組腹腔內(nèi)注射氨溴索6 mg/(kg·d)，二陳湯組予二陳湯10 mL/(kg·d)(制備成免煎顆粒，每克生藥配成3 mL混懸液)灌胃，蔞芩止嗽煎組予蔞芩止嗽煎劑10 mL/(kg·d)(制備成免煎顆粒，每克生藥配成3 mL混懸液)灌胃。上述給藥均每天2次。

2.2 采集生物標本 從造模后開始用藥計算,分別于第8天肌注青霉素后15、30 min，每組隨機處置動物各10只,留取動物標本,檢測各組大鼠不同時段生物標本中青霉素的濃度。

2.2.1 血清 以3.5%水合氯醛0.1 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈采血6 mL。

2.2.2 支氣管肺泡灌洗液 麻醉大鼠仰臥固定于操作臺上，放血處死大鼠,暴露出氣管和雙肺。在氣管下部做橫行切口，夾閉右主支氣管，通過硅膠管用注射器從氣管緩緩注入無菌生理鹽水3 mL灌洗左肺，每次注入后立即回吸得到灌洗液，重復(fù)3次。灌洗液紗布(2層)過濾，回收率為80%～90%?；厥者^濾后的支氣管肺泡灌洗液(BALF)置于塑料離心管中，周圍用冰水(-4～0 ℃)包圍。

2.2.3 肺組織 取大鼠4葉右肺，用預(yù)冷的無菌生理鹽水沖洗3次，洗去凝血塊,用濾紙吸干后稱重，按W(重量)/V(體積)=1/5比例加入預(yù)冷的無菌生理鹽水，置于玻璃勻漿器中研磨15 min，制成10%肺組織勻漿。所有標本立即于4 ℃下2 000 r/min離心15 min，取上清液-80 ℃保存待檢。

2.3 樣品前處理

2.3.1 肺組織樣品前處理 稱取一定量的肺組織勻漿置于50 mL離心管中,加入10 mL磷酸二氫鈉緩沖溶液，均質(zhì)，用10 mL磷酸二氫鈉溶液洗滌均質(zhì)器刀頭后并入離心管中。于振蕩器上震蕩10 min，超聲提取10 min。然后在4 ℃下10 000 r/min離心10 min，取上層液轉(zhuǎn)移至另一離心管，加入10 mL正己烷，如上震蕩離心后棄去上層正己烷層和脂肪，下層提取液過6 cc HLB固相提取小柱(預(yù)先用5 mL甲醇，5 mL超純水活化)，5 mL水淋洗后抽干，最后用5 mL乙腈洗脫，收集洗脫液于樣品管中，氮氣吹干后用乙腈-水(v∶v=1∶9)定容至1 mL,稀釋100倍后過0.2 μm濾膜，供上機檢測。

2.3.2 血清樣品前處理 取50 μL血清樣品于1.5 mL離心管中,加入950 μL乙腈渦旋混勻，8 000 r/min離心5 min。上清液全部轉(zhuǎn)移至收集管中，氮氣吹干后用2 mL乙腈-水(1∶9)溶解，過3 cc HLB固相提取小柱(預(yù)先用3 mL甲醇，3 mL超純水活化)，3 mL水淋洗后抽干，最后用3 mL乙腈洗脫，收集洗脫液于樣品管中,氮氣吹干后用乙腈-水(v∶v=1∶9)定容至1 mL，稀釋20倍后過0.2 μm濾膜，待上機檢測。

2.3.3 灌洗液樣品前處理 取100 μL灌洗液樣品于1.5 mL離心管中，加入900 μL乙腈渦旋混勻，8 000 r/min離心5 min。上清液全部轉(zhuǎn)移至收集管中，氮氣吹干后用2 mL乙腈-水(v∶v=1∶9)溶解,過3 cc HLB固相提取小柱(預(yù)先用3 mL甲醇，3 mL超純水活化)，3 mL水淋洗后抽干，最后用3 mL乙腈洗脫，收集洗脫液于樣品管中，氮氣吹干后用乙腈-水(v∶v=1∶9)定容至1 mL，稀釋10倍后過0.2 μm濾膜，待上機檢測。

2.4 標本測定 采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定生物樣品中青霉素濃度。

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18(1.8 μm，2.1 mm×50 mm)，配在線過濾器(Agilent公司)；流動相A為0.1%乙酸溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～0.5 min，10% B；0.5～1.5 min，10%～70% B；1.5～3.0 min，70% B；3.0～3.1 min，70%～10% B；3.1～4.0 min，10% B；柱溫：35 ℃；流速：0.4 mL/min；進樣體積：5 μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件 電離源：ESI-；毛細管電壓：3 000 V；霧化氣壓力:20 psi；鞘氣溫度：300 ℃；鞘氣流量：11 L/min；干燥氣溫度：250 ℃；干燥氣流量：15 L/min；采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)。青霉素G質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 青霉素G質(zhì)譜參數(shù)

3 結(jié)果

3.1 15 min標本中青霉素濃度 見表2。

表2 15 min標本中青霉素濃度 μg/L

注:※數(shù)據(jù)非正態(tài)分布，故用中位數(shù)表示；與對照組比較，△P=0.008<0.05；與氨溴索組比較，△P=0.043<0.05；與二陳湯組比較，△P=0.026<0.05；與對照組比較，△△P=0.000<0.05；與氨溴索組比較，△△P=0.000<0.05；與二陳湯組比較，△△P=0.009<0.05

3.2 30 min標本中青霉素濃度 見表3。

4 討論

結(jié)合當前的研究文獻及既往的研究經(jīng)驗，我們選擇了大鼠肺組織、血清及灌洗液作為觀察目標。通過提高抗生素在肺組織內(nèi)的轉(zhuǎn)運，提高其肺內(nèi)感染區(qū)域的濃度，增加抗生素的治療效能[6-7]。

東直門醫(yī)院呼吸科在長期的臨床實踐中發(fā)現(xiàn)并提出氣虛血瘀痰阻是COPD穩(wěn)定期的核心病機[8-10]，而對于AECOPD,“痰”與“熱”是其中關(guān)鍵病機[11-13]，清熱化痰法是其基本治療原則[14]。本課題正是基于此，并借鑒國內(nèi)外研究思路，西藥以氨溴索[15]為對照，中藥以化痰方二陳湯為對照， 觀察以清熱化痰法指導(dǎo)的蔞芩止嗽煎[16]對抗生素在肺組織中的藥物濃度的影響，即對抗生素的增效作用的影響。蔞芩止嗽煎由《統(tǒng)旨方》中清金化痰湯加減組成。方中瓜蔞、黃芩、清半夏、浙貝母清熱化痰；漏蘆、連翹清熱解毒；杏仁、前胡宣降肺氣。

表3 30 min標本中青霉素濃度 μg/L

注:※數(shù)據(jù)非正態(tài)分布，故用中位數(shù)表示；與對照組比較，△P=0.055>0.05；與氨溴索組比較，△P=0.181>0.05；與二陳湯組比較，△P=0.753>0.05；與對照組比較，△△P=0.235>0.05；與氨溴索組比較，△△P=0.963>0.05；與二陳湯組比較，△△P=0.283>0.05

實驗結(jié)果顯示，在肺組織標本中，AECOPD痰熱證大鼠模型在肌注青霉素15 min后組織藥物濃度以蔞芩止嗽煎組最高，提示清熱化痰法能提高AECOPD痰熱證大鼠肺組織中的青霉素濃度，并且療效優(yōu)于二陳湯，以及可以提高抗生素在肺組織內(nèi)轉(zhuǎn)運的氨溴索。而30 min時肺組織中藥物濃度各組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義，但蔞芩止嗽煎組與二陳湯組肺組織藥物濃度均高于氨溴索組和對照組，提示中藥化痰法對提高青霉素在肺組織中的轉(zhuǎn)運有一定的療效。綜合分析，基于清熱化痰法的蔞芩止嗽煎可以提高肺組織中青霉素藥物濃度，且以15 min時最明顯，而單純應(yīng)用化痰法治療AECOPD痰熱證起效相對較慢，提示對AECOPD痰熱證，在化痰基礎(chǔ)上及早應(yīng)用清熱藥物可以提高組織藥物濃度，從而提高治療效果。在血清標本中，也有類似結(jié)果，進一步提示，清熱化痰藥物對AECOPD血清及肺組織藥物濃度的影響具有一致性，及早應(yīng)用針對AECOPD痰熱證核心病機的清熱化痰藥物有助于提高藥物濃度，提高治療效果，縮短治療時間。而在灌洗液藥物濃度測定中發(fā)現(xiàn)，不管是15 min組還是30 min組，提示蔞芩止嗽煎可以提高抗生素在肺灌洗液中的濃度，并加速抗生素在灌洗液中的分布，延長起效作用時間。

[1]胡燕,白繼庚,胡先明,等.我國抗生素濫用現(xiàn)狀、原因及對策探討[J].中國社會醫(yī)學(xué)雜志,2013,30(2):128-130.

[2]馬利軍,吳紀珍,牛紅麗,等.氨溴索對頭孢哌酮/舒巴坦肺轉(zhuǎn)運作用的臨床研究[J].中國新藥雜志,2003,12(1):61.

[3]楊常菀,張志新,屠文俊,等.氨溴索對頭孢哌酮肺轉(zhuǎn)運作用的臨床研究[J].臨床肺科雜志,2008,13(6):682,685.

[4]張莉,李金田,劉永琦,等.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型病變特點的研究[J].四川動物,2010,29(2):285-287.

[5]李建生,周紅艷,喬翠霞,等.慢性阻塞性肺疾病急性加重期痰熱證模型的建立與評價[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2010,16(7):553-556.

[6]SETHI S,MURPHY T F.Bacterial infection in chronic obstructive pulmonary disease in 2000:a state of the art review[J].Clinical Microbiology Reviews,2001,14(2):336-363.

[7]李杰,武維屏,羅慧,等.中藥化痰法對青霉素在慢性阻塞性肺疾病急性加重期大鼠肺組織中轉(zhuǎn)運能力的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2013,36(6):404-408.

[8]武維屏,王琦,田秀英,等.肺脹228例臨床治療回顧[J].中國醫(yī)藥學(xué)報,1991,6(3):20-23.

[9]蘇惠萍,武維屏,周紹忠.中醫(yī)藥防治慢性阻塞性肺疾病的思路[J].中醫(yī)雜志,2006,47(1):59-60.

[10]馮淬靈,武維屏,武紅莉,等.益氣活血化痰法治療慢性阻塞性肺疾病76例臨床資料分析[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2007,30(6):419-422.

[11]王至婉,李建生,余學(xué)慶,等.慢性阻塞性肺疾病急性加重期證候及特征的臨床調(diào)查研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2010,25(4):504-509.

[12]李宗平.慢性阻塞性肺疾病辨治探析[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2009,25(1):54-55.

[13]談歐.慢性阻塞性肺疾病急性加重期并發(fā)呼吸衰竭中醫(yī)辨治[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2013,29(5):831-832.

[14]于會勇,王成祥,劉治坤,等.解毒清肺合劑對慢性阻塞性肺疾病急性加重期痰熱蘊肺證模型大鼠氣道杯狀細胞的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2012,19(8):31-33.

[15]姚堅,張建輝,李凱述.國產(chǎn)氨溴索治療呼吸系統(tǒng)疾病療效觀察[J].臨床肺科雜志,2007,12(1):17-18.

[16]李杰,王琦,武維屏,等.中西醫(yī)化痰法對抗生素在COPD肺組織轉(zhuǎn)運能力影響的研究進展[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2012,7(7):633-635,638.