宋小俊,雷 立,李惠民,李玉琴,高吉仁,何西珍,周曙東

(商洛職業(yè)技術學院，陜西 商洛 726000)

連翹入藥在我國已有兩千多年的歷史，是我國臨床常用傳統(tǒng)中藥之一，主產于我國陜西、山西、河南、山東等地。明清以后至今皆以木犀科連翹的果實為連翹正品的唯一來源[1]。秋季果實初熟尚帶綠色時采收，除去雜質，蒸熟，曬干，稱之為“青翹”；果實熟透時采收，曬干，除去雜質，稱之為“老翹”[2]。中藥材連翹主要含有連翹苷、連翹酯苷、異落葉松脂素、異橄欖脂素、蘆丁、槲皮素等苯乙醇苷類、木脂素類、三萜類、黃酮類、酚酸類物質[3-5]。連翹苦，微寒，歸肺、心、膽經，具有清熱解毒，消癰散結，疏散風熱的功效[6]。連翹具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗過敏、抗病毒、抗腫瘤等作用[7-9]。主治溫熱、丹毒、斑疹、癰瘍腫毒、瘰疬、小便淋閉等癥；現(xiàn)代臨床上多用于治療呼吸道感染、急性腎炎、肝炎、腦膜炎等疾病[10]。連翹還是預防和治療禽流感、SARS、甲型H1N1流感等流行性疾病的主要藥物[2]。連翹是商洛市確定的“五大商藥”之一，在商洛的蘊藏量大，分布區(qū)域廣。本研究藥材樣品采自商洛連翹各主要產區(qū)。以連翹苷和連翹酯苷A含量為指標，按照中國藥典標準,采用高效液相色譜法對不同區(qū)縣青翹和老翹中連翹苷、連翹酯苷A含量進行比較研究。

1 實驗材料

連翹果實采自商洛五縣區(qū)7個樣點。經西北農林科技大學梁宗鎖教授鑒定均為正品。2011年7月采集樣品，將所采連翹果實蒸熟、曬干，得“青翹”備用。2011年10月采集樣品，將所采連翹果實曬干，除去雜質,得“老翹”備用。連翹苷及連翹酯苷A標準品均購自中國藥品生物制品鑒定所，甲醇、乙腈等化學試劑均為色譜純，冰醋酸為分析純，試驗用水為純凈水。LC-10AT島津高效液相色譜儀，SPD-10A紫外-可見檢測器，浙江大學N2000色譜工作站;WK-1000A型高速中藥粉碎機(青州市精誠機械有限公司);AUW220型萬分之一電子天平(SARTOO-RIUS公司)；KQ5200B型超聲波清洗儀器(昆山市超聲儀器有限公司)；R501B型旋轉蒸發(fā)儀(無錫市星海王生化設備有限公司)；HH-4型數顯恒溫水浴鍋(金壇市科析儀器有限公司);電熱恒溫DGG-9203AD型鼓風真空干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司)。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件 參照中國藥典方法[6]作適當調整。色譜柱：C18(10 μm，250 mm×4.6 mm)；連翹苷流動相：乙腈-水(30∶70)；檢測波長：277 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃。連翹酯苷A流動相：乙腈-0.4%冰醋酸溶液(15∶85)；檢測波長:333 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃。

2.2 對照品溶液的制備 分別取連翹苷及連翹酯苷A標準品適量，精密稱定。于10 mL容量瓶中甲醇溶解，精確定容至刻度線，得對照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取采自不同產地的青翹和老翹干燥粉末(過五號篩)各1.000 g，至50 mL錐形瓶中，加70%甲醇20 mL，過夜，超聲波提取30 min，搖勻，濾過，靜置,取上清液移入10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，得連翹苷供試品溶液。

精密稱取采自不同產地的青翹和老翹干燥粉末(過五號篩)各1.000 g,至50 mL錐形瓶中，加70%甲醇20 mL，超聲波提取30 min,搖勻，濾過，取上清液移入10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，得連翹酯苷A供試品溶液。

2.4 相關性分析 分別精密吸取連翹苷、連翹酯苷A對照品溶液0.1、0.25、0.50、0.75、1.0 mL置l mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。依次吸取上述溶液10 μL，注入HPLC色譜儀，記錄峰面積。以連翹苷、連翹酯苷A的進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，經回歸處理得進樣量濃度與峰面積的相關系數分別為，r(連翹苷)=0.998 9，r(連翹酯苷A)=0.999 1。表明連翹苷、連翹酯苷A含量和其峰面積之間有很好的相關性。

2.5 精密度試驗 取連翹苷、連翹酯苷A對照品溶液10 μL，重復進樣6次，測定峰面積，結果連翹苷、連翹酯苷A的峰面積RSD分別小于1.624%，1.461%。表明試驗用儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取新制備的供試品溶液10 μL，分別靜置0、2、4、8、16、24 h,注入色譜柱，記錄峰面積，結果青翹樣品中連翹苷、連翹酯苷A質量分數的RSD值分別小于1.0%，1.18%；老翹樣品中連翹苷、連翹酯苷A質量分數的RSD值分別小于1.14%，1.07%。說明樣品在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.7 供試品含量測定 精密吸取藥材供試品溶液10 μL進樣，采用外標法計算，結果見表1、表2。

2.8 重現(xiàn)性試驗 分別取青翹和老翹藥材樣品制備供試品溶液6份,依次進樣，記錄峰面積，各主要色譜峰相對保留時間均小于0.20%， 結果青翹樣品中連翹翹苷、連翹酯苷A含量的RSD分別小于1.20%，1.26%；老翹樣品中連翹苷、連翹酯苷A含量的RSD分別小于1.14%，1.12%。證明此方法重現(xiàn)性良好。

表1 不同產地青翹和老翹中連翹苷含量(n=3) %

表2 不同產地青翹和老翹中連翹酯苷A含量(n=3) %

2.9 回收率試驗 精密稱取樣品1.000 g,分別加入連翹苷、連翹酯苷A標準品適量，按照2.3項方法制備供試品溶液，分別得到連翹苷、連翹酯苷A加樣回收樣品，測定,計算回收率。結果:青翹樣品中連翹苷的平均回收率為99.54%，RSD為1.38%；連翹酯苷A的平均回收率為99.7%，RSD為1.72%。老翹樣品中連翹苷的平均回收率為99.51%,RSD為1.34%；連翹酯苷A的平均回收率為99.64%，RSD為1.27%。

3 分析與討論

連翹的藥用成分較多，關于研究方法的報道也逐年增加。崔洋等[11]對連翹進行了高效液相色譜指紋圖譜研究。吳艷芳等[12]對伏牛山區(qū)青翹與老翹中連翹苷含量進行了測定。朱小強等[13-14]對商洛連翹GAP栽培技術和增產效果進行了研究,但以商洛不同產地連翹藥材為研究對象,結合藥物分析對主成分連翹苷、連翹酯苷A進行分析研究尚未見報道。

本試驗采用HPLC-RPBPCF法，對來自商洛五縣區(qū)不同產地的青翹和老翹藥材進行色譜分析。測定連翹苷、連翹酯苷A含量,采用外標法進行定量計算，并進行了精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和回收率試驗。結果證明，該方法可靠，重復性好，供試品藥材的主要成分連翹苷、連翹酯苷A含量高而且穩(wěn)定。

各產地青翹中連翹苷含量均高于老翹，與吳艷芳研究結果一致[12]，不同產地青翹、老翹中連翹苷含量差異明顯。

各產地青翹中連翹酯苷A含量均高于老翹，不同產地青翹、老翹中連翹酯苷A含量差異十分明顯。

除洛南石門老翹樣品中連翹苷含量為0.106%,其余樣品中連翹苷含量均大于中國藥典規(guī)定的0.15%[6]，最高含量達中國藥典標準的5.5倍。所有樣品連翹酯苷A含量均大于中國藥典標準(0.25%)[6],且最高含量達中國藥典標準的50倍左右，最低含量也超出中國藥典標準約1.5倍。表明做為商洛“五大商藥”之一的連翹，其藥用主要成分含量極高，具有良好的開發(fā)價值。

由于不同產地連翹苷、連翹酯苷A含量差異較大,故在實施商洛連翹藥材的人工種植時，必須重視種質的選擇，建立GAP基地，掌握科學的采摘時間,以保證商洛道地藥材的質量標準。

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