屈巧鳳，姜大成

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117)

林蛙皮含有膠原蛋白、透明質(zhì)酸、多肽、金屬元素等多種化學(xué)成分[1-4]。膠原蛋白是哺乳動物體內(nèi)含量最多的蛋白質(zhì)，占體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25%～30%，相當于體質(zhì)量的6%[5-6]。膠原蛋白因其獨特的結(jié)構(gòu)和功能，被廣泛的應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)學(xué)、造紙等領(lǐng)域[7-11]。本文從藥材粉碎度、加水量、酶的種類3個方面探討從林蛙皮中提取膠原蛋白的影響因素及優(yōu)化條件。

1 實驗材料

取中國林蛙(RanatemporariachensinensisDavid)腹部的皮，干燥，將其粉碎，過60目篩，備用。微型植物試樣粉碎機(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)、TU-1810型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)、ZK-82B型真空干燥箱(上海市實驗儀器總廠)、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)、檸檬酸(天津市福晨化學(xué)試劑廠)、檸檬酸鈉(天津市福晨化學(xué)試劑廠)、對二甲氨基苯甲醛(天津市光復(fù)精細化工研究所)、冰醋酸(北京化工廠)、L-羥脯氨酸(L-Hydroxyproline，批號111578-200201，中國藥品生物制品檢定所)。

2 實驗方法

2.1 林蛙皮中膠原蛋白的提取方法 將上述粉碎好的林蛙皮粉末稱量5 g，加入適量的蒸餾水，以浸沒為準，再分別加入適量的胰蛋白酶和檸檬酸，在30 ℃下提取48 h,過濾，收集濾液，將濾液離心，3 000 r/min，離心15 min，收集上清液，冷凍干燥。即得膠原蛋白粗提物[12]。

2.2 膠原蛋白的含量測定方法 稱量2 g膠原蛋白粗提物，加入50 mL 6 mol/L的鹽酸，120 ℃消解8 h，放冷，揮去鹽酸，過濾，蒸餾水定容至100 mL，取1.5 mL，以1 mol/L的NaOH調(diào)整PH到6.0，定容至25 mL，吸取1 mL，加入1 mL蒸餾水、1 mL檸檬酸緩沖溶液和1 mL氯胺T，25 ℃保溫氧化10 min，然后加入3.5 mol/L高氯酸溶液1 mL，室溫放置10 min，加入對二甲氨基苯甲醛試劑1 mL，震蕩均勻(其低溫易結(jié)晶，使用前應(yīng)加熱)，在65 ℃水浴中保溫10 min，使其顯色，于558 nm下測其吸光度[13-14]。羥脯氨酸與膠原蛋白質(zhì)量換算公式如下：M=C×稀釋倍數(shù)×總體積×換算系數(shù)，式中M—林蛙皮中膠原蛋白的含量；C—消解液中羥脯氨酸的質(zhì)量濃度；換算系數(shù)—10(兩棲類動物膠原蛋白中羥脯氨酸的大體含量)[15]。

3 結(jié)果

3.1 藥材粉碎度的考察 由于林蛙皮較為堅韌并且質(zhì)地較輕，膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)密集，直接水解效果較差，將林蛙皮進行適當?shù)姆鬯榭梢栽黾恿滞芷さ谋砻婷娣e，提高水解效果，具體操作如下:取林蛙皮100 g，用粉碎機進行適度粉碎，分別篩取粒徑為2 mm以下粉末、5 mm以下粉末、10 mm以下粉末各20 g，分別加適量的蒸餾水，以完全浸沒為準，加0.05 g胰蛋白酶，10.08 g檸檬酸，37 ℃時提取48 h，過濾，將濾液冷凍干燥，測定其中膠原蛋白的提取量。通過比較發(fā)現(xiàn)，林蛙皮的粉碎度越大則膠原蛋白的含量越高，所以林蛙皮在提取時必須要粉碎，考慮到粒徑在2 mm以下比較難控制，并且粉碎過程中產(chǎn)生細粉較多，所以確定林蛙皮的粉碎度控制在5 mm以下即可，見表1。

表1 粉碎度、加水量、酶的種類對膠原蛋白含量的影響

3.2 加水量的考察 林蛙皮適度粉碎，取5 mm以下粉末3份，每份20 g，分別加入50、60、70 mL蒸餾水，0.05 g胰蛋白酶，10.08 g檸檬酸，37 ℃時提取48 h，過濾，將濾液冷凍，測定其中膠原蛋白的提取量。通過試驗發(fā)現(xiàn)，加入60 mL的水時膠原蛋白的含量最高，因此，選擇加入60 mL的水，結(jié)果見表2。

表2 優(yōu)選膠原蛋白提取工藝條件正交試驗因素水平表

3.3 酶的種類考察 林蛙皮適度粉碎,取5 mm以下的粉末3分,每分20 g，分別加入60 mL蒸餾水，0.05 g胃蛋白酶、0.05 g胰蛋白酶、0.05 g木瓜蛋白酶，10.08 g檸檬酸，37 ℃時提取48 h ，過濾，將濾液冷凍干燥，測定其中膠原蛋白的提取量。結(jié)果顯示當加入等量的胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶時，胰蛋白酶能夠提取出更多的膠原蛋白，因此林蛙皮酶解時選用胰蛋白酶，結(jié)果見表3。

表3 膠原蛋白提取工藝條件正交試驗結(jié)果表

3.4 正交實驗優(yōu)化 見表4。

表4 膠原蛋白提取工藝正交試驗結(jié)果方差分析表

按照L9(34)正交表進行試驗,稱取林蛙皮，粉碎成5 mm以下,共9份，每份5 g，按照表3進行試驗，以膠原蛋白的含量(方法見“1.2.2膠原蛋白的含量測定”)為考核指標。根據(jù)直觀分析和方差分析的結(jié)果：提取時間對試驗結(jié)果影響最顯著，其次為加入的檸檬酸的量，對膠原蛋白的提取影響最小的是加入的胰蛋白酶的含量，由此可見，各因素對試驗結(jié)果影響的重要性依次為A>D>B>C，根據(jù)各個因素對指標的影響程度，確定膠原蛋白提取的最優(yōu)工藝為：A3B3C1D2，即加水量是60 mL，提取時間是72 h，提取溫度是37 ℃，加胰蛋白酶的量是1%(0.05 g)，加檸檬酸的量是0.8 mol/L。

4 結(jié)論

綜上確定了林蛙皮中膠原蛋白的最佳提取工藝：將中國林蛙的腹部皮干燥，粉碎，過60目篩，取5 g，加入60 mL水，再分別加入1%的胰蛋白酶和0.8 mol/L的檸檬酸，在37 ℃下提取72 h，過濾，收集濾液，將濾液離心，3 000 r/min，離心15 min，收集上清液，冷凍干燥。即得膠原蛋白粗提物。在此優(yōu)化條件下提取，膠原蛋白的提取率為67.09%。

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