邱彩玲， 呂文河， 呂典秋， 白艷菊， 魏 琪，劉尚武， 董學(xué)志， 耿宏偉， 萬書明， 魏峭嶸

(1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué),哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所,哈爾濱 150086)

4個馬鈴薯品種感染馬鈴薯紡錘塊莖類病毒>(PSTVd)的癥狀

邱彩玲1,2， 呂文河1*， 呂典秋2*， 白艷菊1,2， 魏 琪2，劉尚武2， 董學(xué)志2， 耿宏偉2， 萬書明2， 魏峭嶸1

(1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué),哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所,哈爾濱 150086)

馬鈴薯紡錘塊莖類病毒在中國及世界許多國家都是檢疫性病害，該病害可大幅度降低馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)。根據(jù)植株及塊莖的癥狀，汰除感病的馬鈴薯種薯，是控制PSTVd傳播和危害的重要手段。本研究利用分子克隆及測序技術(shù)，分離并鑒定了PSTVd的分離物351-17，利用PSTVd田間接種技術(shù)，分別接種了4個黑龍江省常用的馬鈴薯品種‘夏坡地’、‘克新18’、‘荷蘭15’和‘尤金’，對其侵染后第一代的株高、葉片、塊莖外觀和單株產(chǎn)量進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果表明：4個供試馬鈴薯品種感染PSTVd后均表現(xiàn)出了一定的癥狀，其中‘克新18’在株高、葉片和塊莖的癥狀方面最為明顯，單株產(chǎn)量下降顯著，表明其對PSTVd非常敏感。

PSTVd； 馬鈴薯品種； 癥狀

馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(Potatospindletuberviroid，PSTVd)在中國及其他諸多國家都是檢疫性病害。PSTVd不僅能夠侵染馬鈴薯，還能侵染番茄、茄子、燈籠果、鱷梨以及許多觀賞植物[1-4]，是國內(nèi)馬鈴薯生產(chǎn)上的一種重要病害。目前國內(nèi)研究較多的是PSTVd對于馬鈴薯的危害，因為該病害在我國馬鈴薯產(chǎn)區(qū)已經(jīng)普遍發(fā)生。馬鈴薯被PSTVd侵染后的癥狀表現(xiàn)不僅因品種而異，而且還與PSTVd的株系以及環(huán)境因素有關(guān)[5]。在脫毒馬鈴薯種薯生產(chǎn)過程中，根據(jù)植株及塊莖的表現(xiàn)，在馬鈴薯花期和/或收獲后進(jìn)行田間和/或庫房檢測，來汰除感病的馬鈴薯種薯，是有效控制PSTVd傳播蔓延和危害的重要手段。研究不同馬鈴薯品種被PSTVd感染后的癥狀表現(xiàn)，是評估病害損失的前提條件。本研究利用分子克隆及測序技術(shù)鑒定PSTVd，并利用PSTVd田間接種技術(shù)，分別接種黑龍江省常用的4個馬鈴薯品種，對侵染后第一代的株高、葉片、塊莖的癥狀及單株產(chǎn)量等性狀進(jìn)行調(diào)查，比較不同品種之間的差異，以便為馬鈴薯脫毒種薯的田間檢測、庫房檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品種及種薯級別

脫毒馬鈴薯原原種，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所提供，品種為‘夏坡地’、‘克新18’、‘荷蘭15’和‘尤金’，原原種大小均一，重約5 g。

1.1.2 供試PSTVd分離物

2011年在哈爾濱田間采集經(jīng)鑒定感染PSTVd的馬鈴薯塊莖，品種為‘黑彩’，編號為351-17。塊莖發(fā)芽后進(jìn)試管保存，待后續(xù)試驗使用。

1.2 方法

1.2.1 PSTVd鑒定及序列測定

采用農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測》(NY/T 1962—2010)[6]中規(guī)定的RT-PCR方法鑒定田間采集的樣品，利用TIANGEN公司的離心柱型瓊脂糖凝膠回收試劑盒對擴(kuò)增的特異性產(chǎn)物進(jìn)行回收，純化。將回收產(chǎn)物連接到TaKaRa公司生產(chǎn)的pMD18-T載體中，次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到TransGen Biotech生產(chǎn)的大腸桿菌 DH5α中，觀察過夜培養(yǎng)的菌落。選取6個單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，將培養(yǎng)后得到的菌落進(jìn)行鑒定，鑒定方法仍采用《馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測》(NY/T 1962—2010)中規(guī)定的方法。重組質(zhì)粒由上海生工生物工程公司進(jìn)行序列測定，測定結(jié)果采用BioEdit Sequence Alignment Editor軟件分析，并在GenBank中進(jìn)行BLAST檢索。

1.2.2 田間試驗

2012年5月25日，在黑龍江省哈爾濱市道外區(qū)民主農(nóng)業(yè)生態(tài)園防蟲網(wǎng)室內(nèi)播種上述供試品種，苗期(7月2日)接種上述經(jīng)鑒定過的PSTVd(接種方法見1.2.4)，7月25日取植株上部葉片，利用核酸斑點雜交法(nucleic acid spot hybridization，NASH)[7]鑒定接種情況，沒有接種成功的于8月4日再接種1次，10月8日收獲。用NASH方法進(jìn)一步鑒定2012年收獲的塊莖感染PSTVd情況。

2013年5月30日，按照2012年的田間布置方式，播種2012年收獲的塊莖(感染PSTVd的塊莖)，花期調(diào)查株高、葉片癥狀，收獲時測產(chǎn)并調(diào)查塊莖外觀等性狀。

1.2.3 播種方式及數(shù)據(jù)處理

每個供試品種播種2行，每行20株，株行距為35 cm×70 cm，采用常規(guī)的施肥和田間管理方式，每個品種設(shè)立2行對照(接種健康葉片)，對照與接種PSTVd的植株間種植隔離行，田間管理時單獨使用工具，除去地頭等特殊位置的植株外，每個處理隨機(jī)選取10株進(jìn)行調(diào)查，用DPS 7.05進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.2.4 接種

(1)磷酸鹽緩沖液配制

溶液A：7.164 g Na2HPO4·12H2O，加蒸餾水定容至100 mL；溶液B: 3.121 g NaH2PO4·2H2O，加蒸餾水定容至100 mL。取6.1 mL溶液A+3.9 mL溶液B+190 mL無菌水，混勻即為10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液。

(2)接種物準(zhǔn)備

稱取0.1 g左右感染PSTVd分離物351-17的葉片，加入1 mL磷酸鹽緩沖液，快速、充分研磨即為接種液，迅速用于接種。對照則選用健康馬鈴薯葉片代替感染PSTVd的葉片制備接種液。

(3)接種方式

首先在植株上部完全展開的葉片上均勻噴灑600目的金剛砂，蘸取接種液逆著葉片表皮毛的方向適度摩擦葉片，稍后用蒸餾水沖掉葉片表面的金剛砂，完成接種。

2 結(jié)果與分析

2.1 PSTVd序列測定結(jié)果

PSTVd 分離物351-17的6個克隆序列測定結(jié)果(圖1)一致。該序列經(jīng)GenBank進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果表明，與來自俄羅斯的PSTVd分離物Tver′-96(登錄號：EU879923.1)最接近，相似度為99%。但Tver′-96在俄羅斯以外并沒有報道，目前尚無致病力等相關(guān)信息。

圖1 PSTVd分離物351-17全長cDNA核苷酸序列Fig.1 The full-length cDNA sequence of PSTVd isolate 351-17

2.2 株高

感染PSTVd后，所有品種植株高度均極顯著降低(表1，圖2和圖3)。降低幅度從13.47%至45.34%不等，其中‘克新18’降低幅度最大，平均株高降低45.34%，僅達(dá)到33.40 cm。供試的4個品種接種PSTVd后與對照相比，總體降低幅度為30.11%，與對照(CK)相比，株高差異達(dá)極顯著水平。

表1 株高和產(chǎn)量方差分析1)Table 1 Analysis of variance on plant height and tuber yield

1)**表示在1%水平下極顯著，*表示在5%水平下顯著。
*and**indicate significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.

圖2 馬鈴薯不同品種感染PSTVd后的株高Fig.2 Plant height of different potato varieties infected with PSTVd

圖3 不同馬鈴薯品種感染PSTVd后的株高Fig.3 Plant height of different potato varieties infected with PSTVd

2.3 單株產(chǎn)量

4個品種感染PSTVd后單株產(chǎn)量均極顯著降低(表1、圖4)，總體單株產(chǎn)量降低了40.19%；每個品種感染PSTVd和對照相比差異都達(dá)極顯著水平，但不同品種的降低幅度不同，‘克新18’仍然是降低幅度最大的品種，其單株產(chǎn)量降低了58.85%。

圖4 不同馬鈴薯品種感染PSTVd的產(chǎn)量Fig.4 Tuber yield per plant of different potato varieties infected with PSTVd

2.4 葉片癥狀

圖5為4個供試品種感染PSTVd后的葉片表現(xiàn)。從圖5中可以看出，‘克新18’和‘荷蘭15’的葉片皺縮相對比較嚴(yán)重，‘夏坡地’和‘尤金’表現(xiàn)相對較輕，與這些品種在株高上變化的差異相對一致。

圖5 不同品種感染PSTVd后的葉片癥狀Fig.5 Leaf symptoms of different potato varieties infected with PSTVd

2.5 塊莖癥狀

感染PSTVd后各品種的塊莖均表現(xiàn)不同程度的變化，呈現(xiàn)出一定的品種特性(圖6)。具體表現(xiàn)為：‘夏坡地’塊莖變小，細(xì)長，芽眼突起非常明顯，個別塊莖出現(xiàn)龜裂，“姜狀”畸形是本品種感染PSTVd的典型特征；‘克新18’塊莖頂芽端變粗，臍部變細(xì)，塊莖變長，變小，表皮嚴(yán)重龜裂，是本品種感染PSTVd的典型特征；‘荷蘭15’塊莖變細(xì)長，變小，未見明顯表皮龜裂，部分芽眼突起，多數(shù)塊莖呈現(xiàn)豌豆?fàn)?，是本品種感染PSTVd的典型特征；‘尤金’塊莖表皮龜裂，變小，變長，芽眼突起。

圖6 不同品種馬鈴薯感染PSTVd后的塊莖癥狀Fig.6 Tuber symptoms in different potato varieties infected with PSTVd

3 討論

本研究通過對株高、葉片癥狀、單株產(chǎn)量和塊莖外觀的調(diào)查結(jié)果顯示，供試的4個馬鈴薯品種感染PSTVd后，均表現(xiàn)出了植株矮化、葉片皺縮、塊莖變小、產(chǎn)量降低和塊莖畸形等癥狀。其中‘克新18’表現(xiàn)最為明顯，株高降低幅度、葉片皺縮程度、產(chǎn)量降低幅度以及塊莖的畸形表現(xiàn)均非常顯著，表明該品種對PSTVd非常敏感。

由于試驗條件有限，無法一次性研究更多的馬鈴薯品種感染PSTVd的表現(xiàn)，但從本研究中仍能總結(jié)出一些馬鈴薯感染PSTVd后的特點，比如，植株高度都下降，塊莖有不同形式、不同程度的畸形以及產(chǎn)量降低等，可以為脫毒馬鈴薯種薯的田間檢測和庫房檢測提供技術(shù)指導(dǎo)。

PSTVd侵染不同品種的馬鈴薯會引起不同的癥狀，本研究結(jié)果進(jìn)一步驗證了這一結(jié)論。但是，不同品種為何會表現(xiàn)出不同的癥狀，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。此外，本研究接種用的PSTVd分離物351-17的致病力尚不確定，對馬鈴薯癥狀表現(xiàn)的影響程度也不是十分清楚，后續(xù)試驗將進(jìn)一步對其致病性等進(jìn)行研究，完善本研究的試驗結(jié)果，更好地了解PSTVd與馬鈴薯品種的互作效應(yīng)，為PSTVd的防控提供指導(dǎo)。

[1]Querci M, Owens R, Bartolini I, et al. Evidence for heterologous encapsulation ofPotatospindletuberviroidin particles ofPotatoleafrollvirus[J]. Journal of General Virology, 1997,78:1207-1211.

[2]Ward L I, Tang J, Veerakone S, et al. First report ofPotatospindletuberviroidin cape gooseberry(Physalisperuviana) in New Zealand[J]. Plant Disease, 2010, 94(4):479.

[3]Verhoeven J Th J, Botermans M, Roenhorst J W, et al. First report ofPotatospindletuberviroidin cape gooseberry(Physalisperuviana) from Turkey and Germany[J]. Plant Disease, 2009, 93(3)：316.

[4]Verhoeven J Th J, Jansen C C C, Roenhorst J W.Streptosolenjamesonii‘Yellow’, a new host plant ofPotatospindletuberviroid[J]. Plant Pathology，2008，57(2):399.

[5]Anon. EPPO Standars-Diagnostis protocols for regulated pests-PM7/33Potatospindletuberpospivivoid[J]. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin， 2004,31:257-269.

[6]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部種植業(yè)管理司. NY/T 1962-2010，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測[S/OL].農(nóng)業(yè)部公告第1515號，2010.

[7]呂典秋，李學(xué)湛，于德才，等. 馬鈴薯類病毒(PSTVd)非放射性標(biāo)記cDNA探針制備及其在檢測上的應(yīng)用[J]. 植物病理學(xué)報，2005，35(2):104-108.

SymptomsoffourpotatovarietiesinfectedwithPotatospindletuberviroid(PSTVd)

Qiu Cailing1,2, Lü Wenhe1, Lü Dianqiu2, Bai Yanju1,2, Wei Qi2,Liu Shangwu2, Dong Xuezhi2, Geng Hongwei2, Wan Shuming2, Wei Qiaorong1

(1.NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China; 2.Virus-freeSeedlingResearchInstituteofHeilongjiangAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150086,China)

Potatospindletuberviroid(PSTVd) is a quarantine disease in China and many other countries around the world. The disease can significantly reduce tuber yield and quality. Eliminating the infected seed potatoes according to the symptoms of plants and tubers is an important and useful measure to control the spread and hazard of PSTVd. Using molecular cloning and sequencing techniques, PSTVd 351-17 was isolated and identified. Four common potato varieties(‘Shepody’, ‘Kexin 18’, ‘Helan 15’ and ‘Youjin’) were inoculated with the PSTVd 351-17 in the fields. Plant height, symptom of leaf and tuber, as well as yield per plant were investigated on the first infected generation. The results indicated that all the four potato varieties showed some symptoms. Among the four varieties， The ‘Kexin 18’ showed obvious symptoms of plant height, leaf and tuber appearance and dramatically decreased yield per plant, so it is very sensitive to PSTVd.

PSTVd； potato variety; symptom

2013-12-23

：2014-03-25

哈爾濱市應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)項目(2013AE6AW059)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-10-P14)；黑龍江省杰出青年科學(xué)基金(JC 201018)

S 432.4

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.030

* 通信作者 E-mail:呂文河whlu@neau.edu.cn; 呂典秋smallpotatoes@126.com