唐爽爽， 劉志恒*， 余朝閣， 趙廷昌

(1. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,沈陽(yáng) 110866; 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 北京 100193)

9種殺菌劑對(duì)西瓜炭疽病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定及配比試驗(yàn)

唐爽爽1， 劉志恒1*， 余朝閣1， 趙廷昌2

(1. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,沈陽(yáng) 110866; 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 北京 100193)

為篩選防治西瓜炭疽病的高效低毒殺菌劑，緩解和治理生產(chǎn)中病菌對(duì)藥劑的抗性，在室內(nèi)離體條件下采用生長(zhǎng)速率抑制法及孢子萌發(fā)抑制法測(cè)定了9種殺菌劑對(duì)西瓜炭疽病菌(Colletotrichumorbiculare)的毒力。結(jié)果表明，嘧菌酯、咪鮮胺和甲基硫菌靈對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的EC50在0.093 3～0.118 2 mg/L之間，均小于1 mg/L，表明西瓜炭疽病菌對(duì)上述殺菌劑比較敏感；百菌清、烯肟菌酯和戊菌唑的EC50在2.310 1～5.925 9 mg/L，病菌對(duì)藥劑的敏感程度相對(duì)較低；代森錳鋅、惡霉靈和多菌靈的EC50分別為36.876 3、74.466 6和99.898 5 mg/L，抑菌活性較差。孢子萌發(fā)試驗(yàn)中，嘧菌酯、咪鮮胺和甲基硫菌靈對(duì)病菌孢子萌發(fā)的抑制活性最高，EC50在0.069 4～0.167 2 mg/L之間；百菌清、烯肟菌酯、代森錳鋅的抑制活性次之，EC50在1.853 0～9.503 9 mg/L之間；多菌靈的抑制活性相對(duì)最低，EC50為99.335 3 mg/L。將兩種不同作用機(jī)理的殺菌劑嘧菌酯與咪鮮胺按照2∶1的比例混配，聯(lián)合毒力測(cè)定和評(píng)價(jià)結(jié)果表明兩者混配對(duì)抑制西瓜炭疽病菌具有增效作用。

西瓜炭疽病菌； 殺菌劑； 毒力測(cè)定； 混配

西瓜是世界十大水果之一，據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計(jì)，西瓜在世界果品中占第5位，在夏季市場(chǎng)水果供應(yīng)上居首位，被譽(yù)為“夏季水果之王”。我國(guó)是世界上最大的西瓜生產(chǎn)國(guó)，占世界總面積和總產(chǎn)量的45%以上[1]。西瓜炭疽病[Colletotrichumorbiculare(Berk.etMont.) Arx]是西瓜生產(chǎn)上重要病害之一，在世界各地西瓜栽培地區(qū)均有發(fā)生，尤其以濕度大地區(qū)發(fā)生最普遍。近年來(lái)，隨著全球變暖趨勢(shì)的加重以及西瓜種植面積的不斷增加，西瓜重茬面積不斷擴(kuò)大，導(dǎo)致炭疽病日益加重。西瓜炭疽病一旦發(fā)生，就會(huì)造成嚴(yán)重減產(chǎn)，甚至絕收[2]。在遼寧省西瓜主產(chǎn)區(qū)遼中縣，西瓜炭疽病廣泛發(fā)生，對(duì)西瓜生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[3]。近年來(lái)，西瓜炭疽病在遼寧省建平縣露地西瓜栽培中有逐年加重的趨勢(shì)，已成為西瓜栽培生產(chǎn)中的3大主要病害之一，嚴(yán)重影響了西瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于西瓜炭疽病菌的研究多側(cè)重于病害的發(fā)生原因與規(guī)律，有的已深入到分子水平[5]。生產(chǎn)上由于缺乏抗性品種，化學(xué)藥劑防治仍是控制病害的重要措施，但某種藥劑長(zhǎng)期單一使用、用藥次數(shù)和劑量不斷增加，導(dǎo)致藥劑抗藥性出現(xiàn)的問(wèn)題，已在很多病害防治中有所顯露而影響了病害防控效果。鑒此，本文選用9種殺菌劑原藥，采用菌絲生長(zhǎng)速率抑制法和分生孢子萌發(fā)抑制法對(duì)西瓜炭疽病菌進(jìn)行了室內(nèi)毒力測(cè)定，并研究了殺菌劑混配的抑菌效果，以期為西瓜炭疽病的田間防治篩選出作用機(jī)制不同且高效、低毒的殺菌劑，為生產(chǎn)上減緩病菌抗藥性的產(chǎn)生以及病害的有效防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種來(lái)源

2012年8月，于遼寧省沈陽(yáng)新民市、營(yíng)口蓋州市和阜新彰武縣采集西瓜炭疽病標(biāo)樣，采用常規(guī)組織分離法[6]獲得病原菌，經(jīng)致病性測(cè)定驗(yàn)證。將病菌經(jīng)純培養(yǎng)擴(kuò)繁后保藏備用。

1.2 供試藥劑

選用生產(chǎn)上常規(guī)應(yīng)用的9種殺菌劑：95%嘧菌酯原藥(湖北晟隆化工有限公司)、97%咪鮮胺原藥(湖北晟隆化工有限公司)、97%甲基硫菌靈原藥(江蘇省新沂利民化工有限責(zé)任公司)、98%百菌清原藥(山東華陽(yáng)農(nóng)藥肥料化工有限公司)、95%烯肟菌酯原藥(杭州中潤(rùn)生物科技有限公司)、95%戊菌唑原藥(浙江省杭州宇龍化工有限公司)、80%代森錳鋅原藥(江蘇省新沂利民化工有限責(zé)任公司)、95%惡霉靈原藥(山東京博農(nóng)化有限公司)及98%多菌靈原藥(上海臨空化工貿(mào)易有限公司)。

1.3 接種體及孢子懸浮液的制備

病菌培養(yǎng)：應(yīng)用PSA培養(yǎng)基，將分離純化的病菌于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)15 d，用直徑7 mm的滅菌打孔器在菌齡相近、長(zhǎng)勢(shì)一致的菌落部位打取菌餅備用。

菌懸液制備：取培養(yǎng)30 d的PSA平板，每皿加入無(wú)菌水5 mL，配成分生孢子懸浮液，孢懸液濃度為40倍鏡下平均每視野60～80個(gè)孢子[7]。

1.4 試驗(yàn)方法

對(duì)西瓜炭疽病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定，分別采取菌絲生長(zhǎng)速率抑制法[8]和孢子萌發(fā)抑制法[9]進(jìn)行篩選，計(jì)算9種供試殺菌劑的抑制中濃度(EC50)。

菌絲生長(zhǎng)速率抑制法：根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇各藥劑適當(dāng)?shù)?個(gè)濃度(表1)，將配制好的供試藥劑母液按照設(shè)定的濃度比例加入到已融化并冷卻至50 ℃左右的PSA培養(yǎng)基中，充分混勻后分別倒入直徑9 cm的滅菌培養(yǎng)皿中，制成系列濃度的含藥PSA平板。以不加藥劑但含等量溶劑的PSA平板為對(duì)照。接入直徑7 mm的菌餅，25 ℃恒溫培養(yǎng)。每處理設(shè)3次重復(fù)。15 d后采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑[10]，并計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100。

分生孢子萌發(fā)抑制法：根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇各藥劑適當(dāng)?shù)?個(gè)濃度(表2)，孢懸液濃度為40倍鏡下60～80個(gè)孢子，分別吸取孢懸液0.5 mL與配制好的待測(cè)農(nóng)藥母液(含2%葡萄糖)0.5 mL等量混合，采用凹玻片萌發(fā)法。無(wú)菌水為對(duì)照。25 ℃恒溫保濕培養(yǎng)。每處理3次重復(fù)。12 h后測(cè)定孢子萌發(fā)率。每個(gè)處理隨機(jī)鏡檢100個(gè)分生孢子，記載孢子萌發(fā)數(shù)。

孢子萌發(fā)率(%)=已萌發(fā)孢子數(shù)/鏡檢孢子總數(shù)×100；

孢子萌發(fā)抑制率(%)=(對(duì)照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率)/對(duì)照孢子萌發(fā)率×100。

2種殺菌劑混配效果測(cè)定：根據(jù)單劑毒力測(cè)定結(jié)果，對(duì)毒力最高的2種藥劑95%嘧菌酯和97%咪鮮胺進(jìn)行混配[11]，有效成分配比為：4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4，每個(gè)配比配制成相應(yīng)5個(gè)濃度梯度。采用生長(zhǎng)速率法對(duì)西瓜炭疽病菌進(jìn)行聯(lián)合毒力測(cè)定。計(jì)算混配劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑菌率，分別求得藥劑不同混配比例的毒力回歸方程、EC50和相關(guān)系數(shù)。并根據(jù)Wadley公式計(jì)算增效系數(shù)SR[12]，確定不同比例混劑的相互作用。

EC50理論值 =(a+b)/〔(a/EC50A)+(b/EC50B)〕

SR=EC50(理論值)/EC50(實(shí)際值)

式中A、B分別為95%嘧菌酯和97%咪鮮胺單劑；a、b分別為相應(yīng)單劑在混劑中含量的比率；以SR值代表相互作用程度。當(dāng)SR≤0.5時(shí)，表示拮抗作用；當(dāng)SR≥1.5時(shí)，表示增效作用；當(dāng)SR在0.5～1.5之間時(shí)，表示加和作用。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件和Excel軟件對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和計(jì)算[13]，將菌絲生長(zhǎng)抑制率和孢子萌發(fā)抑制率分別換算成幾率值(y)，藥劑濃度換算成濃度對(duì)數(shù)(x)，按濃度對(duì)數(shù)與幾率值回歸法求得線性回歸方程(毒力回歸式)y=a+bx，并以回歸方程計(jì)算各供試藥劑對(duì)西瓜炭疽菌菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)的抑制中濃度(EC50)、幾率值與濃度對(duì)數(shù)之間回歸的相關(guān)系數(shù)r值，比較不同殺菌劑對(duì)西瓜炭疽病菌的抑制作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 9種殺菌劑對(duì)西瓜炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

不同濃度的殺菌劑與其對(duì)西瓜炭疽病菌的抑制率之間是一種不對(duì)稱(chēng)的S形曲線關(guān)系，將濃度轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)，抑制率轉(zhuǎn)化為幾率值時(shí)，濃度與抑制率之間表現(xiàn)為一元線性回歸關(guān)系，通過(guò)相關(guān)性分析，可以檢驗(yàn)線性關(guān)系的顯著性，分析比較殺菌劑對(duì)病菌的毒力。

各供試藥劑供試濃度、毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)r和EC50結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 供試9種殺菌劑對(duì)西瓜炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用Table 1 Toxicity of nine fungicides on mycelium growth of Colletotrichum orbiculare

根據(jù)菌絲生長(zhǎng)抑制法測(cè)定的EC50結(jié)果(表1)表明，供試9種殺菌劑基本歸為4類(lèi)：95%嘧菌酯、97%咪鮮胺和97%甲基硫菌靈，EC50分別是0.093 3、0.108 3和0.118 2 mg/L，比其他供試藥劑的EC50小，說(shuō)明這3種藥劑抑菌效果最好；98%百菌清、95%烯肟菌酯、95%戊菌唑，EC50介于2.310 1～5.925 9 mg/L之間，在供試藥劑中EC50較小，說(shuō)明這3種藥劑抑菌效果較好；80%代森錳鋅EC50為36.876 3 mg/L，說(shuō)明該藥劑抑菌效果一般；95%惡霉靈和98%多菌靈的EC50分別為74.466 6和99.898 5 mg/L，抑菌效果很差。

回歸方程的斜率與殺菌劑對(duì)病菌的敏感性成正比。按回歸方程的斜率k，供試藥劑可以分為2類(lèi)：95%戊菌唑、97%甲基硫菌靈、95%烯肟菌酯、98%百菌清、98%多菌靈、95%嘧菌酯和97%咪鮮胺，斜率k在1.028 2～1.380 3之間，是供試藥劑中斜率k較大的，說(shuō)明西瓜炭疽病菌對(duì)這7種藥劑的敏感性較高；95%惡霉靈、80%代森錳鋅，斜率k在0.666 9～0.829 7之間，是供試藥劑中斜率k較小的，說(shuō)明西瓜炭疽病菌對(duì)這2種藥劑的敏感性較低。

2.2 9種殺菌劑對(duì)西瓜炭疽病菌分生孢子萌發(fā)的影響

各藥劑供試濃度、毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)r和EC50結(jié)果見(jiàn)表2。

根據(jù)分生孢子萌發(fā)抑制法測(cè)定的EC50結(jié)果(表2)表明，供試9種殺菌劑基本歸為4類(lèi)：95%嘧菌酯、97%咪鮮胺和97%甲基硫菌靈，EC50分別是0.069 4、0.090 7和0.167 2，大于其他藥劑的EC50，說(shuō)明這3種藥劑抑菌效果最好；98%百菌清、95%烯肟菌酯、80%代森錳鋅，EC50介于1.853 0～9.503 9 mg/L之間，是供試藥劑中EC50較小的，說(shuō)明這3種藥劑抑菌效果較好；95%戊菌唑的EC50為14.830 3 mg/L，說(shuō)明該藥劑抑菌效果一般；95%惡霉靈的EC50為79.271 1 mg/L，抑菌效果較差，98%多菌靈的EC50為99.335 3 mg/L，說(shuō)明該藥劑抑菌效果最差。

表2 供試9種殺菌劑對(duì)西瓜炭疽病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用Table 2 Toxicity of nine fungicides on spores germination of C.orbiculare

回歸方程的斜率與殺菌劑對(duì)病菌的敏感性成正比。按回歸方程的斜率k，供試藥劑可以分為2類(lèi)：95%惡霉靈、95%戊菌唑、98%多菌靈、95%嘧菌酯、95%烯肟菌酯、97%咪鮮胺和80%代森錳鋅，斜率k在1.219 1～1.573 2之間，大于其他供試藥劑的斜率k，說(shuō)明西瓜炭疽病菌對(duì)這7種藥劑的敏感性較高；97%甲基硫菌靈、98%百菌清，斜率k在0.894 4～0.917 5之間，是供試藥劑中斜率k較小的，說(shuō)明西瓜炭疽病菌對(duì)這2種藥劑的敏感性較低。

2.3 殺菌劑嘧菌酯和咪鮮胺混配聯(lián)合毒力測(cè)定

由表3可知，95%嘧菌酯與97%咪鮮胺以 4∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶4的比例混配對(duì)西瓜炭疽病菌的EC50分別為0.075 7、0.043 3、0.103 9、0.107 1和0.105 9 mg/L，均表現(xiàn)出了顯著的抑菌作用。同時(shí)，95%嘧菌酯與97%咪鮮胺的4∶1和2∶1混配劑的EC50均小于95%嘧菌酯單劑和97%咪鮮胺單劑的EC50，表明這兩種比例混配劑對(duì)西瓜炭疽病病菌的抑制效果明顯好于單劑。95%嘧菌酯與97%咪鮮胺的4∶1和2∶1兩種混配劑的SR，分別為1.268 2和2.260 0，前者介于0.5和1.5之間，表示加和作用，后者SR大于1.5，表明比例為2∶1的混配表現(xiàn)為增效作用。其余4種混配比例的SR均介于0.5和1.5之間，均為加和作用。

3 結(jié)論與討論

菌絲生長(zhǎng)速率抑制法的毒力測(cè)定結(jié)果表明，9種殺菌劑對(duì)西瓜炭疽病菌的EC50大小順序?yàn)椋亨拙?咪鮮胺>甲基硫菌靈>百菌清>烯肟菌酯>戊菌唑>代森錳鋅>惡霉靈>多菌靈，其中嘧菌酯對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng)，EC50為0.093 3 mg/L；百菌清、烯肟菌酯和戊菌唑的抑制作用較好；多菌靈的抑制作用最弱，EC50為99.335 3 mg/L。分生孢子萌發(fā)法的毒力測(cè)定結(jié)果表明，9種藥劑對(duì)西瓜炭疽病菌的EC50大小順序?yàn)椋亨拙?咪鮮胺>甲基硫菌靈>百菌清>烯肟菌酯>代森錳鋅>戊菌唑>惡霉靈>多菌靈，其中嘧菌酯對(duì)分生孢子萌發(fā)的毒力最強(qiáng)，EC50為0.069 4 mg/L；百菌清、烯肟菌酯、代森錳鋅毒力次之；多菌靈的EC50為99.335 3 mg/L，毒力最小。嘧菌酯和咪鮮胺為毒力最高的2種藥劑，這與周文靜等[14]的研究結(jié)果相一致，與付余波等[15]報(bào)道的梨炭疽病菌的毒力測(cè)定相吻合。在本試驗(yàn)中，采用聯(lián)合毒力測(cè)定得出當(dāng)嘧菌酯與咪鮮胺以2∶1的比例混配時(shí)表現(xiàn)為增效作用。

表3 嘧菌酯與咪鮮胺混配對(duì)西瓜炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用Table 3 Toxicity of azoxystrobin and prochloraz mixed on mycelium growth of C. orbiculare

同一殺菌劑對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制作用可存在差異，戊菌唑?qū)z生長(zhǎng)抑制作用較強(qiáng)，但對(duì)孢子萌發(fā)抑制作用較弱，故可在發(fā)病的初期使用；而代森錳鋅對(duì)孢子萌發(fā)抑制作用較強(qiáng)，對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制作用較弱，故可在發(fā)病前噴施,預(yù)防病菌孢子的初侵染，并可在發(fā)病期噴施，防止孢子再侵染，與王春明等[9]報(bào)道結(jié)果較為一致。

不同殺菌劑敏感性測(cè)定中斜率越大說(shuō)明病菌對(duì)藥劑的反應(yīng)靈敏度越高，即隨著質(zhì)量濃度的增加，抑菌率明顯增大[16]。西瓜炭疽病菌的菌絲生長(zhǎng)對(duì)咪鮮胺的敏感性最高，孢子萌發(fā)對(duì)代森錳鋅和咪鮮胺的敏感性最高。

多菌靈是苯并咪唑類(lèi)殺菌劑，若長(zhǎng)期使用，易產(chǎn)生抗藥性[17]，試驗(yàn)中多菌靈對(duì)該菌的毒力最差，從而推測(cè)西瓜炭疽病菌對(duì)多菌靈已產(chǎn)生了一定的抗藥性，這可能與當(dāng)?shù)靥镩g多菌靈使用量和噴藥次數(shù)過(guò)多相關(guān)，此結(jié)果與多菌靈的藥理相符合。葡萄、香蕉、蘋(píng)果等植物上的膠孢炭疽病菌也出現(xiàn)類(lèi)似的不同程度敏感性降低的情況[18-20]，與本試驗(yàn)結(jié)果相吻合。因此，應(yīng)對(duì)多菌靈的抗藥性給予高度的重視，及早采取相應(yīng)措施，例如輪換使用不同作用機(jī)制的殺菌劑，合理適量用藥，并進(jìn)一步研究炭疽菌對(duì)多菌靈的抗藥性機(jī)理，避免抗藥性加重。

室內(nèi)藥劑毒力測(cè)定結(jié)果雖可看出藥劑對(duì)菌絲和孢子萌發(fā)具有很好的抑制效果，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上防治該病提供了理論依據(jù)。但由于受很多因素的影響，藥劑在培養(yǎng)皿內(nèi)的抑菌活性和在田間植物上的作用效果不一定完全一致，因此還有待做進(jìn)一步田間的防治效果試驗(yàn)。

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ToxicitydeterminationandproportioningtestsofninefungicidestoColletotrichumorbiculare

Tang Shuangshuang1, Liu Zhiheng1, Yu Zhaoge1, Zhao Tingchang2

(1.CollegeofPlantProtection,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China;2.InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

The effects of nine fungicides and their mixtures onColletotrichumorbicularewere tested with the mycelium growth rate and spores germination methods in vitro in laboratory. The results showed that azoxystrobin, prochloraz and thiophanate-methyl had significant inhibition activity on mycelium growth, with the EC50values ranged from 0.093 3 to 0.118 2 mg/L. Chlorothalonil, enestroburin and penconazole were less effective, with EC50values between 2.310 1 and 5.925 9 mg/L. Mancozeb, hymexazol and carbendazim were least effective, with EC50values of 36.876 3, 74.466 6 and 99.898 5 mg/L, respectively. Azoxystrobin, prochloraz and thiophanate-methyl had the best inhibitory actions on the spore germination, with the EC50values of 0.069 4-0.167 2 mg/L. Chlorothalonil， enestroburin and mancozeb had less effects(with EC50of 1.853 0-9.503 9 mg/L), while carbendazim(with EC50of 99.335 3 mg/L) took the last place. Synergistic inhibition on mycelium growth was obtained when azoxystrobin and prochloraz were mixed.

Colletotrichumorbiculare; fungicides; toxicity determination; mixture

2013-12-11

：2014-01-11

國(guó)家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-26)

S 481.9

：BDOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.033

* 通信作者 E-mail:805141919@qq.com