朱 燁 張宇輝 陳 明

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院心臟醫(yī)學(xué)部，上海 200120)

原子力顯微鏡測(cè)量心肌細(xì)胞楊氏模量的研究現(xiàn)狀

朱 燁 張宇輝 陳 明*

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院心臟醫(yī)學(xué)部，上海 200120)

自原子力顯微鏡面世以來，已越來越廣泛地被應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域的研究，尤其在細(xì)胞的微觀領(lǐng)域有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)與價(jià)值。文中評(píng)述了近些年利用其測(cè)量表征細(xì)胞彈性的楊氏模量的方法和進(jìn)展，并著重論述楊氏模量在心血管疾病中的應(yīng)用研究。心肌細(xì)胞的楊氏模量不僅呈現(xiàn)隨年齡的增長(zhǎng)而增大的趨勢(shì)，且與心血管的疾病有明顯的相關(guān)關(guān)系。因此，測(cè)量心肌細(xì)胞的楊氏模量可以研究病變心肌細(xì)胞的物理改變，有助于了解心臟疾病，尤其是心衰及心梗的病理變化。

楊氏模量; 原子力顯微鏡; 心肌細(xì)胞; 力學(xué)特性; 分子生物學(xué)

引言

隨著微觀分子生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的研究人員從分子的層面出發(fā)，研究生物體的生理或病理機(jī)制。細(xì)胞是組成生物體的基本單位，細(xì)胞表面物理性質(zhì)的微小改變就會(huì)引起生物體宏觀的生理病理改變；反之，生物體宏觀的生理病理改變也往往伴隨著微觀細(xì)胞表面物理性質(zhì)的改變[1-2]。因此，通過研究細(xì)胞的力學(xué)特性可以幫助人們了解生物體的生理病理狀態(tài)，從而為一些疾病的診斷和治療提供更多的依據(jù)。利用原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)測(cè)量細(xì)胞的楊氏模量(Young’s modulus)，具有分辨率高、對(duì)細(xì)胞影響小、可行性強(qiáng)等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，成為測(cè)量細(xì)胞楊氏模量的首選方法。本文就AFM測(cè)量細(xì)胞及心肌細(xì)胞楊氏模量的原理及應(yīng)用做一綜述。

1 原子力顯微鏡及其測(cè)試技術(shù)

1986年，德國(guó)科學(xué)家研制出了首臺(tái)原子力顯微鏡。1989年，原子力顯微鏡第一次應(yīng)用于細(xì)胞水平，開創(chuàng)了細(xì)胞微觀研究的新領(lǐng)域[4]。如圖1所示，AFM工作時(shí)，連接在微懸臂上的探針尖端部的原子與細(xì)胞表面原子接觸，針尖對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一個(gè)作用力，同時(shí)細(xì)胞對(duì)針尖有個(gè)反作用力，這個(gè)反作用力使與針尖連接的微懸臂產(chǎn)生位移，繼而使投射在微懸臂上的激光信號(hào)產(chǎn)生偏轉(zhuǎn)，位移偏轉(zhuǎn)量與反作用力遵循胡克定律，通過光斑顯示器收集信號(hào)的變化獲取細(xì)胞的彈性曲線圖，再利用赫茲模型處理得到細(xì)胞的楊氏模量，由此獲得細(xì)胞力學(xué)特性的信息[3-5]。

圖1 原子力顯微鏡原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of an atomic force-fluorescence microscopy(AFM)

與傳統(tǒng)方法相比，AFM具有以下優(yōu)勢(shì)：1、納米級(jí)分辨率使觀察更細(xì)致，可用于定量[7]觀察樣品的三維結(jié)構(gòu)，且圖像分辨率高。以往的傳統(tǒng)方法只能觀察二維層面的結(jié)構(gòu)，也不能達(dá)到定量觀測(cè)細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)[7,9,11,13]的標(biāo)準(zhǔn)。在這一方面，AFM與傳統(tǒng)方法相比是質(zhì)的飛躍。2、由于在測(cè)量過程中，探針與細(xì)胞表面產(chǎn)生的作用力是極微弱的原子力，所以這種方法對(duì)細(xì)胞的活性及生理狀況基本沒有影響或影響極其微弱。3、操作簡(jiǎn)單，可行性強(qiáng)，易于推廣[3]。4、適用范圍廣泛，AFM可以用于測(cè)量傳統(tǒng)方式無法測(cè)量的液態(tài)環(huán)境下的活細(xì)胞的物理特性[8,10,12]，這樣可以動(dòng)態(tài)地反映細(xì)胞在生物體內(nèi)的生理特征[1-2]，而不只是局限于細(xì)胞靜態(tài)下的某一特定生理狀態(tài)。

2 楊氏模量的臨床應(yīng)用

楊氏模量又稱彈性模量，是在彈性范圍內(nèi)彈性材料的正向壓力與正向壓變的比值。1807年以英國(guó)科學(xué)家Thomas Young的名字命名。早期主要應(yīng)用于物理領(lǐng)域，現(xiàn)在已在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被越來越廣泛的應(yīng)用。樣本的楊氏模量越大，樣本越不容易發(fā)生形變，彈性越小。

人體內(nèi)各組織的楊氏模量從低到高依次為軟組織(1～1 000 kPa)，結(jié)締組織和軟骨(100～1 000 kPa)，骨(108kPa以上)[14]。

楊氏模量是最能體現(xiàn)物質(zhì)力學(xué)特性的元素。隨著微觀分子生物學(xué)的發(fā)展，楊氏模量測(cè)量已廣泛應(yīng)用于微生物細(xì)胞[15]、心肌細(xì)胞[16]、MDCK細(xì)胞[17]。為了實(shí)時(shí)研究成骨細(xì)胞的力學(xué)特性，孫嘉倫等利用AFM測(cè)量成骨細(xì)胞的楊氏模量，發(fā)現(xiàn)楊氏模量的大小與作用力刺激的時(shí)間和頻率成正相關(guān)，與刺激結(jié)束后間隔的時(shí)間成負(fù)相關(guān)[18]。Balint等經(jīng)AFM分析腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的二維圖像得到其楊氏模量，發(fā)現(xiàn)甘露醇處理過的細(xì)胞的楊氏模量(0.93±0.04)MPa小于未經(jīng)處理的細(xì)胞楊氏模量(8.04±0.12)MPa，即處理后細(xì)胞彈性變大了[19]。Cross等研究癌細(xì)胞的剛度特征時(shí)發(fā)現(xiàn)，良性細(xì)胞比轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞硬30%左右，這一研究結(jié)果可應(yīng)用于臨床檢測(cè)細(xì)胞的癌變性質(zhì)[20]。Chouinard等使用AFM觀測(cè)人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，低密度脂蛋白含量與血管內(nèi)皮細(xì)胞的彈性有密切關(guān)系[21]。Martens等在研究肌球蛋白在細(xì)胞彈性改變的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在加阻凝蛋白后抑制劑0.5～1 h后，其楊氏模量由正常細(xì)胞的19.9 kPa減低到7.9 kPa，證明了肌球蛋白確實(shí)影響細(xì)胞的彈性[22]。Lekka等分別比較高血壓患者、糖尿病患者與正常人紅細(xì)胞楊氏模量，結(jié)果顯示,患者的紅細(xì)胞彈性較正常人低，且變化與年齡相關(guān)[23]。Lam等研究化療藥物對(duì)細(xì)胞的彈性影響時(shí)，用化療藥物分別處理急性淋巴和急性骨髓細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理后細(xì)胞的平均彈性模量為4.696 kPa，遠(yuǎn)高于未經(jīng)處理的細(xì)胞的彈性模量0.197 kPa[24]。此研究結(jié)果還顯示，細(xì)胞剛度的改變與藥物種類無關(guān)，與藥物劑量密切相關(guān)。Cai等挑選抑制率高于50%的幾種不同濃度的ART溶液，將Jurkat細(xì)胞分別置于這幾種不同濃度的ART溶液中，24 h后觀測(cè)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和機(jī)械性能的改變[5]。實(shí)驗(yàn)觀測(cè)到，細(xì)胞膜發(fā)生了改變且超微結(jié)構(gòu)也變復(fù)雜了。利用AFM追蹤單個(gè)細(xì)胞的機(jī)械性能發(fā)現(xiàn)，單個(gè)細(xì)胞的楊氏模量從對(duì)照組的(0.648±0.037)kPa降低到實(shí)驗(yàn)組的(0.254±0.035)kPa，同時(shí)細(xì)胞的剛度增加了1.5倍。Steinhauser研究高靜水壓對(duì)人骨力學(xué)性質(zhì)的影響時(shí)，將骨的一側(cè)邊置于300 MPa的作用力下10 min，另一側(cè)無力施加作為對(duì)照，測(cè)得300 MPa處理后的骨細(xì)胞的楊氏模量為(200.7±38.7)MPa，對(duì)照組的楊氏模量為(186.5±34.3)MPa[25]。

AFM測(cè)量楊氏模量雖然操作簡(jiǎn)單易行，但也受很多因素的影響，不同條件下測(cè)量出來的同一細(xì)胞的楊氏模量可能有很大的差別。因此，在實(shí)驗(yàn)前必須掌握以下影響因素才能在實(shí)驗(yàn)中提高測(cè)量的準(zhǔn)確性。

2.1細(xì)胞處理方式的影響

文獻(xiàn)[2]報(bào)道，細(xì)胞樣本經(jīng)固定后其楊氏模量較生理?xiàng)l件下大：粘液球菌用戊二醛固定后，細(xì)胞彈性(1.34±0.66)kPa比正常情況下(0.25±0.18)kPa增加了4倍多；紅血球用福爾馬林處理后的彈性(119.5±15.0)kPa比生理?xiàng)l件下(16.05±2.30)kPa增加了將近10倍。

2.2基底物性質(zhì)的影響

文獻(xiàn)[26]報(bào)道，在研究不同剛度培養(yǎng)基上細(xì)胞粘附形變的數(shù)值時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞更容易親近接近自身剛度的培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞剛度一定時(shí)，粘附力在一定范圍內(nèi)隨培養(yǎng)基剛度的增加而增大。Domke等在實(shí)驗(yàn)中得出，4種不同粗糙度的基底物上造骨細(xì)胞的彈性模量由高到低排序?yàn)椋衡?8.8 kPa)、聚苯乙烯(7.5 kPa)、玻璃(5.5 kPa)、鈦釩(2.1 kPa)，故選用不同的基底物也可能會(huì)影響測(cè)定結(jié)果[27]。Abu-Lail等在研究中發(fā)現(xiàn)，基底液的極性不同，致同一種細(xì)胞的彈性模量不同，極性越低，彈性模量越大[28]。

2.3測(cè)量區(qū)域的影響

Methur等用AFM測(cè)量臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的楊氏模量，測(cè)量過程中發(fā)現(xiàn)核區(qū)細(xì)胞膜的楊氏模量(7.22±0.46)kPa約為邊緣區(qū)細(xì)胞膜楊氏模量(1.27±0.36)kPa的6倍[29]。Rotsch等的研究則表明伸展區(qū)細(xì)胞膜楊氏模量小于穩(wěn)定區(qū)[30]。

3 測(cè)量心肌細(xì)胞楊氏模量的進(jìn)展

世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)表明，起源于冠狀動(dòng)脈疾病的缺血性心衰和心梗，在世界總死亡人數(shù)中的比例高達(dá)29%[31]。心衰主要是由于心臟的泵血功能不足以滿足全身的供血需求引起的，血液的供不應(yīng)求是疾病所致的心臟收縮功能的變化引起的，因此測(cè)量心肌細(xì)胞的收縮力和楊氏模量就可以定量的探究心衰的原理及心衰細(xì)胞的分子改變[32]。Azeloglu等用一種新型AFM壓痕技術(shù)來測(cè)量新生大鼠自然搏動(dòng)狀態(tài)下的心肌細(xì)胞的剛度[33]，結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞的彈性模量在收縮期的(26.2±5.1)kPa和舒張期的(7.8±4.1)kPa之間循環(huán)，且探針沿著細(xì)胞軸線探測(cè)到，心臟收縮時(shí)心肌細(xì)胞的空間異質(zhì)性與肌纖維下面的肌小結(jié)的結(jié)構(gòu)有關(guān)。Lieber等測(cè)量不同年齡的大鼠心肌細(xì)胞的楊氏模量[34]，4個(gè)月大的大鼠心肌細(xì)胞的彈性模量((35.1±0.7)kPa,n=53)較30個(gè)月大的大鼠心肌細(xì)胞的彈性模量((42.5±1.0)kPa,n=58)要小，證明單個(gè)老化心肌細(xì)胞的彈性模量有顯著增加，驗(yàn)證了心肌細(xì)胞機(jī)械性能隨年齡增長(zhǎng)降低這一假說。在這之前，隨年齡增長(zhǎng)心室心肌細(xì)胞剛度的變化在業(yè)內(nèi)一直爭(zhēng)議不休。

心梗后心室重建是由于大量細(xì)胞外基質(zhì)在局部心肌缺血壞死區(qū)沉積并纖維化引起的。功能性組織的損失和心肌彈性及收縮性的減低，導(dǎo)致了機(jī)械低效的惡性循環(huán)，引起負(fù)面重構(gòu)，影響舒張，最終造成心衰。Hiesinger等將基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(stromal cell-drived factor,SDF)運(yùn)送到缺血心肌，發(fā)現(xiàn)缺血心肌的微血管灌注明顯增加并且維持了心室的幾何形狀和功能[35]。他們認(rèn)為：這種可以增加微血管血液循環(huán)的SDF療法，可以拯救梗死邊緣組織，從而提高心肌細(xì)胞彈性，最終達(dá)到改善機(jī)械效率、維持心室?guī)缀涡螤畹哪康?。Berry將注射了人間質(zhì)干細(xì)胞的大鼠的冠脈結(jié)扎，建立心梗模型。兩周后測(cè)量楊氏模量，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組心梗區(qū)心肌細(xì)胞的楊氏模量是對(duì)照組小鼠心肌細(xì)胞楊氏模量的3倍[36]。c11, c13, c33,c44, c66這5個(gè)剛性系數(shù)，是用來描述表征單向排列的強(qiáng)化的纖維軟組織的彈性線性性能的。Hoffmeister等通過測(cè)量福爾馬林固定的牛跟腱細(xì)胞和福爾馬林固定的人心肌細(xì)胞的楊氏模量來分析這5個(gè)剛度系數(shù)[37]。基于這些心肌細(xì)胞的單向標(biāo)本的楊氏模量的角關(guān)系引入模型，來估測(cè)左室壁更加復(fù)雜的纖維結(jié)構(gòu)的特征。薄帽纖維粥樣斑塊(TCFAs)的斷裂，加之隨后的血栓形成，是心肌梗死的主要原因。TCFAs包括兩部分，大的軟脂塊和其上覆蓋的薄的堅(jiān)硬纖維帽。Baldewsing等為了觀察動(dòng)脈硬化并量化血小板應(yīng)變藥物療法，定量分析這兩部分的形態(tài)和剛度，基于楊氏模量重建法，從血管內(nèi)超聲測(cè)量出的血小板應(yīng)變彈性圖中，重建出了血小板的楊氏模量圖[38]。心肌梗死的大小和位置的不同，對(duì)左室收縮和舒張功能的影響，至今未在醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中確切定義。Chiaramida等認(rèn)為心肌細(xì)胞楊氏模量的大小，可以用來評(píng)價(jià)室壁厚度，室壁厚度與心室收縮末期容積和心室的幾何形狀共同調(diào)配左室壓力-容積關(guān)系，他們將有限元模型與循環(huán)系統(tǒng)的電子模擬模型結(jié)合起來，產(chǎn)生與臨床現(xiàn)象一致的壓力-容積波形，進(jìn)而使整個(gè)左心室的收縮和左心室局部室壁運(yùn)動(dòng)異常與血流動(dòng)力學(xué)結(jié)合起來[39]。然而Forrester等測(cè)量正常犬心肌細(xì)胞和心梗后犬心肌細(xì)胞的楊氏模量，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的楊氏模量比對(duì)照組降低了41%，盡管由于心梗，左室壁的厚度之后會(huì)增加，但該實(shí)驗(yàn)證明心梗后1 h內(nèi)室壁厚度就會(huì)減小，提示測(cè)量心肌細(xì)胞的楊氏模量較僅用壓力-容積曲線更加敏感、準(zhǔn)確[40]。

4 展望

綜上所述，用AFM測(cè)量細(xì)胞的楊氏模量，獲取細(xì)胞彈性及超微結(jié)構(gòu)信息，已經(jīng)成為全球細(xì)胞分子生物學(xué)研究的最熱門的焦點(diǎn)之一。人們?cè)絹碓疥P(guān)注如何從分子生物的角度探索細(xì)胞的生理病理性質(zhì)，更好地研究疾病的病因及生理改變，從而進(jìn)一步研究診斷與治療手段。由于AFM擁有納米級(jí)分辨率，且具有測(cè)量活體細(xì)胞的動(dòng)態(tài)參數(shù)等優(yōu)勢(shì)，測(cè)定細(xì)胞楊氏模量具有很廣闊的研究前景。心肌梗死、心衰及心肌肥厚等心臟疾病發(fā)生時(shí)，病變區(qū)域心肌的彈性會(huì)發(fā)生顯著的改變，彈性這一概念雖只是細(xì)胞的一個(gè)物理特性，卻能整體反映細(xì)胞的狀態(tài)。雖然楊氏模量測(cè)量細(xì)胞彈性目前只停留在細(xì)胞階段，無法輕易將其推廣到臨床應(yīng)用，只能用作疾病的診斷與治療的研究。但是，研究心肌細(xì)胞的楊氏模量可以從微觀角度觀測(cè)疾病的發(fā)生發(fā)展?fàn)顩r，也可為控制日益增長(zhǎng)的心臟疾病作出巨大貢獻(xiàn)。然而，心肌細(xì)胞楊氏模量的測(cè)量大多是采用靜態(tài)測(cè)量，因良好狀態(tài)下的心肌細(xì)胞都為搏動(dòng)態(tài)而非靜止態(tài)，若能推廣動(dòng)態(tài)測(cè)量楊氏模量的方法將會(huì)有更大的應(yīng)用價(jià)值。今后，可以進(jìn)一步改良AFM儀器，例如將其與高分辨聲學(xué)儀器結(jié)合，實(shí)現(xiàn)觀測(cè)活體細(xì)胞的三維動(dòng)態(tài)圖像。另外，在測(cè)量心肌細(xì)胞楊氏模量的同時(shí)，可觀測(cè)心肌細(xì)胞的電生理及形態(tài)變化，多角度、全方位研究心肌細(xì)胞的病理生理改變。

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ResearchStatusoftheMeasurementforYoung’sModulusofMyocardialCellsUsingAtomicForceMicroscopy

ZHU Ye ZHANG Yu-Hui CHEN Ming*

(HeartCenterofShanghaiEastHospitalAffiliatedtoTongjiUniversity,Shanghai200120)

Since the first atomic force microscopy (AFM) came into the world, it has been used in various fields, especially in cellular studies because of its own advantages. This article reviews not only AFM application in in measuring the Young’s modulus that is a parameter reflecting cells stiffness, but also the research progress of Young’s modulus in heart diseases. More researches reported the Young’s modulus increases along with the age and is related to heart diseases. It is helpful for understanding mechanical and pathologic changes in heart diseases, especially in heart failure and myocardial infarction in myocardial cells by determination of Young’s modulus.

Young’s modulus; atomic force-fluorescence microscopy (AFM); myocardial cell; mechanics property; molecular biology

10.3969/j.issn.0258-8021. 2014. 01.014

2013-05-04， 錄用日期：2013-09-10

上海市浦東新區(qū)科技發(fā)展基金創(chuàng)新資金(PKJ2010-Y16)；上海市衛(wèi)生局青年基金(2010Y012)；上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀青年醫(yī)學(xué)人才項(xiàng)目(PW Rq201004)

R318

A

0258-8021(2013) 06-0093-05

*通信作者。E-mail: mingchen1283@vip.163.com