姚永強(qiáng)，韓 雪，曹銘謙，方 紅，解繼平

(大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，遼寧 大連 116001)

緊密連接蛋白Claudin-3在人乳腺癌組織的表達(dá)與臨床意義

姚永強(qiáng)，韓 雪，曹銘謙，方 紅，解繼平

(大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，遼寧 大連 116001)

目的 探討Claudin-3在不同轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)個(gè)數(shù)乳腺癌患者中表達(dá)的差異。方法 將128例乳腺癌組織標(biāo)本按淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)分組，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)個(gè)數(shù)<4個(gè)為A組，≥4個(gè)為B組，2組各64例。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測2組乳腺癌組織Claudin-3的表達(dá)水平并進(jìn)行比較。結(jié)果 A組Claudin-3 mRNA表達(dá)低于B組，2組比較有顯著性差異(P<0.05)。不同年齡、激素受體狀態(tài)、CerbB-2、p53、ki67和組織學(xué)分級(jí)患者Claudin-3表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 Claudin-3表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與預(yù)后不良有關(guān)。

乳腺癌；Claudin-3；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

WHO最新研究結(jié)果顯示，全球每年新增乳腺癌患者超過120萬。乳腺癌作為女性高發(fā)腫瘤，嚴(yán)重威脅著女性的生命及健康。每年約有20萬乳腺癌患者死于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。故復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是造成乳腺癌患者死亡的主要原因[1]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌的主要轉(zhuǎn)移途徑，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況是預(yù)測乳腺癌患者復(fù)發(fā)及死亡的獨(dú)立預(yù)后因素。腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)制異常復(fù)雜。上皮間葉轉(zhuǎn)化(EMT)是惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間葉性細(xì)胞形態(tài)的過程，是惡性腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的起始階段，主要表現(xiàn)為腫瘤邊緣細(xì)胞(前緣癌細(xì)胞)緊密連接的破壞[2]。緊密連接是細(xì)胞間連接形式的一種，主要存在于上皮細(xì)胞間的連接復(fù)合體中。惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的過程可以促使上皮細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的破壞，使上皮細(xì)胞獲得一個(gè)遷移性的間質(zhì)表型，促使腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)距離的轉(zhuǎn)移形成。Claudin是構(gòu)成細(xì)胞間緊密連接復(fù)合體的骨架蛋白之一，研究發(fā)現(xiàn)多種上皮性惡性腫瘤中Claudin蛋白表達(dá)異常，Claudin-3表達(dá)的改變與很多上皮細(xì)胞惡性腫瘤的惡性程度及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。關(guān)于緊密連接中Claudin-3的表達(dá)與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究暫無明確定論。本實(shí)驗(yàn)選擇浸潤性導(dǎo)管癌標(biāo)本128例，采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測Claudin-3表達(dá)在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)患者中的差異，意在探討Claudin-3表達(dá)與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為臨床預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后提供新的指標(biāo)。

1 臨床資料

1.1 一般資料 128例乳腺癌標(biāo)本采自2012于我院經(jīng)手術(shù)治療、術(shù)前未進(jìn)行新輔助治療(新輔助化療及新輔助內(nèi)分泌治療)的乳腺癌標(biāo)本。均于術(shù)中、術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)為浸潤性導(dǎo)管癌。術(shù)中清掃淋巴結(jié)個(gè)數(shù)符合國際標(biāo)準(zhǔn)(清掃淋巴結(jié)總數(shù)均≥10個(gè))。入組患者均為女性，年齡38～75歲，中位年齡48歲。為更好地研究轉(zhuǎn)移期癌組織，標(biāo)本取自以腫瘤邊緣為中點(diǎn)，向腫瘤組織及正常乳腺組織各進(jìn)深0.5 cm。標(biāo)本離體后2min內(nèi)用液氮保存。乳腺癌的診斷及常規(guī)病理資料由2位病理醫(yī)生盲法閱片后提供。按淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移多少分為2組：A組患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)<4個(gè)，腫瘤長徑(3.13±1.35)cm，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)(2.1±0.8)個(gè)；B組患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)≥4個(gè)，腫瘤長徑(3.28±1.26)cm,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)(12.1±5.2)個(gè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞總RNA的提取 采用Trizol(TakaRe公司)按照說明書提取組織細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法測定RNA的濃度和純度，A260/A280表達(dá)在1.8～2.2的標(biāo)本方可轉(zhuǎn)為cDNA。

1.2.2 cDNA的合成 總RNA 1.0 μL，5×PrimescriptTMBuffer 2.0 μL，PrimescriptTMRT Enzyme MIX Ⅰ 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，RNase Free dH2O 5.5 μL。37 ℃孵育15 min，85 ℃ 5 s終止反應(yīng)。4 ℃保存。

1.2.3 引物和探針的設(shè)計(jì)與合成 采用Primer designer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。GAPDH和Claudin-3上下游引物均由大連TakaRa生物制劑有限公司提供。GAPDH為5’-CCATG TAGTTGAGGTCAATGAAG-3’，3’-GGTGAAGGTCGGAGT CAACG-5’；Claudin-3為5’-CTGCTCTGCTGCTCGTGTCC-3’，3’-TTAGACGTAGTCCTTGCGGTCGTAG-5’。

1.2.4 RT-PCR 2×SYBR?Premix Ex TaqTM5.0 μL，PCR Forword Primer 0.5 μL，PCR Reverse Primer 0.5 μL，H2O 3.0 μL，cDNA液 1.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min變性；95 ℃ 20 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)融解曲線分析：95 ℃ 55 s。讀取結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組標(biāo)本免疫組化染色結(jié)果分析 2組患者雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、癌基因(HER2)、核增殖抗原(Ki67)、抑癌基因(p53)表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 2組患者臨床病理學(xué)參數(shù)比較 例

2.2 乳腺癌組織的Claudin-3 mRNA表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系 對(duì)128例乳腺癌標(biāo)本進(jìn)行Claudin-3 mRNA檢測結(jié)果顯示，A組的Claudin-3 mRNA表達(dá)率顯著低于B組(P<0.05)；而不同年齡、激素受體狀態(tài)、CerbB-2、Ki67、p53和組織學(xué)分級(jí)患者Claudin-3表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 Claudin-3表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)128例乳腺癌患者按淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移多少分為A、B 2組，但2組乳腺癌組織大小無明顯差異，2組患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)存在明顯差異的原因用現(xiàn)有的影像及檢驗(yàn)學(xué)指標(biāo)無法解釋。臨床工作中，筆者通過檢測乳腺癌組織中ER、PR、CerbB-2、p53、Ki67的表達(dá)情況來指導(dǎo)患者進(jìn)一步治療方案及判斷患者的預(yù)后。正常人的CerbB-2癌基因?yàn)榉羌せ顮顟B(tài)，部分乳腺癌患者的CerbB-2受體在細(xì)胞膜過度表達(dá)可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的分裂、擴(kuò)增，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。ER、PR的表達(dá)是評(píng)估乳腺癌患者預(yù)后和預(yù)測激素治療反應(yīng)的參數(shù)。Ki-67為增殖細(xì)胞核抗原，是一種與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，其表達(dá)的變化可反映細(xì)胞的增殖能力，Ki-67的高表達(dá)一般預(yù)示腫瘤細(xì)胞擴(kuò)增、侵襲、轉(zhuǎn)移的能力較強(qiáng)，是乳腺癌患者預(yù)后不佳的原因。p53蛋白屬于抑癌基因，正常情況下通過參與細(xì)胞周期來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化，其與惡性腫瘤的產(chǎn)生、調(diào)控和凋亡等關(guān)系密切，其變異與乳腺癌發(fā)生有密切關(guān)系。p53蛋白表達(dá)陽性者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較多， 故目前研究認(rèn)為p53蛋白表達(dá)上調(diào)提示乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性較大。本組結(jié)果顯示2組患者在上述檢測指標(biāo)方面無明顯差異。但2組患者在臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)上有明顯差異，而此差異對(duì)于患者預(yù)后來說有極大的影響。因此除p53、Ki67等癌細(xì)胞增殖性指標(biāo)外，臨床還需要一種新的病理學(xué)指標(biāo)來直接評(píng)價(jià)乳腺癌組織與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，A組Claudin-3表達(dá)明顯低于B組,故認(rèn)為Claudin-3表達(dá)的改變可能與乳腺癌的浸潤與轉(zhuǎn)移存在一定的相關(guān)性。

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征。大多數(shù)癌癥患者并非死于原發(fā)性癌而是死于轉(zhuǎn)移性癌。腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制非常復(fù)雜，涉及多種黏附因子、基質(zhì)蛋白酶、細(xì)胞因子以及相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制和相關(guān)基因的改變。腫瘤前緣癌細(xì)胞從原發(fā)腫瘤分離之后，侵襲到周圍的組織，分解細(xì)胞與細(xì)胞間緊密連接，改變細(xì)胞與基質(zhì)的黏著部位，進(jìn)行解離去極化，即EMT。通常EMT在正常的胚胎發(fā)育中起著重要作用，與惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移也密切聯(lián)系。腫瘤前緣癌細(xì)胞為發(fā)生EMT的主要場所，其重要的表現(xiàn)為惡性腫瘤細(xì)胞的活化與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，其結(jié)果是最終僅有少數(shù)腫瘤細(xì)胞可以在周圍組織中立足，局部形成新生血管，進(jìn)而形成一個(gè)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)移灶。這其中緊密連接的破壞在乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮著重要的作用。

Claudin蛋白是由Tsukahara等[4]研究Claudin缺失的成纖維細(xì)胞時(shí)被發(fā)現(xiàn)和分離的，當(dāng)時(shí)命名為Claudin-1和Claudin-2，迄今已有24個(gè)人類的Claudin家族成員被發(fā)現(xiàn)。Claudin蛋白屬于跨膜蛋白,參與維持緊密連接的選擇滲透性和細(xì)胞極化，其表達(dá)有高度的組織特異性，多種上皮性惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中往往存在著Claudin異常表達(dá)[5]。

研究表明，Claudin-3在許多上皮細(xì)胞腫瘤中表達(dá)上調(diào),且其上調(diào)的幅度與腫瘤組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，故Claudin-3可作為臨床判斷惡性腫瘤患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記[6]。Claudin-3作為緊密連接的主要跨膜蛋白，在細(xì)胞間傳輸物質(zhì)能量的過程中起著重要的連接作用。有研究表明，Claudin-3 和Claudin-4 蛋白在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)上調(diào)與卵巢癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在一定的相關(guān)性；Claudin-3蛋白在正常的卵巢上皮組織細(xì)胞中的表達(dá)極低甚至不表達(dá)，而在上皮性卵巢惡性腫瘤細(xì)胞中Claudin-3蛋白表達(dá)明顯增高，且其上調(diào)的幅度與腫瘤組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，這種表達(dá)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[7]。我國學(xué)者通過對(duì)胃癌組織的研究檢測發(fā)現(xiàn)Claudin-1與Claudin-3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，Claudin-3 表達(dá)上調(diào)可以使組織的完整性遭到破壞，使腫瘤細(xì)胞易于脫離原發(fā)灶，向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而使腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)[8]。也有學(xué)者對(duì)前列腺癌和良性前列腺增生組織的Claudin-3的表達(dá)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，Claudin-3 mRNA在前列腺癌和良性前列腺增生組織中表達(dá)水平有明顯差異，其在前列腺癌的表達(dá)水平明顯高于良性前列腺組織[9]。Claudin-3表達(dá)的上調(diào)可以增強(qiáng)惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲力和生存力，而這種效應(yīng)的產(chǎn)生可能與增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2 ) 的活性有關(guān)。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是構(gòu)成細(xì)胞基底膜主要成分的一類糖蛋白，是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的組織屏障?；|(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)是降解ECM和基底膜(BM)的主要執(zhí)行者。MMPs對(duì)ECM的降解作用可以幫助活化的癌細(xì)胞EMT后發(fā)生內(nèi)滲。MMP-2和是降解型膠原中最主要的溶解酶之一,不僅可以降解ECM，而且可以破壞BM。Szasz等[10]認(rèn)為，在惡性乳腺癌組織中MMP-2的表達(dá)是明顯增高的,如患者還伴有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移則其激活比例更加明顯。

Claudin-3是產(chǎn)氣莢膜桿菌腸毒素(CPE)的受體, CPE與細(xì)胞表面蛋白Claudin-3結(jié)合后能誘導(dǎo)細(xì)胞溶解。應(yīng)用CPE可以顯著抑制鼠乳腺癌細(xì)胞的生長，這為乳腺癌的綜合性治療提供了更多的方法，對(duì)于預(yù)防、治療乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提供新的方法及思路[11]。

總之，Claudin-3表達(dá)的異常與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在一定的相關(guān)性，可能對(duì)于乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移起到促進(jìn)作用。但Claudin-3在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中參與的傳導(dǎo)通路、調(diào)控因子至今仍不清楚，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。而CPE是否可以成為乳腺癌患者綜合性治療的一部分，仍需進(jìn)行探索及臨床觀察。

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Expression of tight junction protein Claudin-3 in breast cancer tissues and its clinical significance

Yao Yongqiang, Han Xue, Cao Mingqian, Fang Hong, Xie Jiping

(The Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, Dalian 116001, Liaoning, China)

Objective It is to investigate the difference of Claudin-3 expression between breast cancer patients had different number of metastatic lymph nodes. Methods 128 breast cancer tissue specimens were divided into two groups according to the number of metastatic lymph nodes, the number of metastatic lymph nodes < 4 in Group A, and ≥4 in Group B, there were 64 cases in each group. The different expression of Claudin-3 in Group A and B were examined by RT-PCR and compared. Results The level of Claudin-3 was significantly lower in Group A than that in Group B, there was significant difference (P<0.05). There was no significant difference in patiens with different age, status of hormone receptor, CerB-2, p53, ki67 and histologial type (allP>0.05)。 Conclusion Increasing expression of Claudin-3 is associated with the metastasis of breast cancer and lead to poor prognosis

breast cancer; Claudin-3; lymph nodes metastasis

姚永強(qiáng)，男，副主任醫(yī)師，副教授，從事甲狀腺及乳腺疾患的診療與研究。

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.30.008

R737.9

A

1008-8849(2014)30-3329-03

2014-02-05