蘇春麗,唐傳紅,張勁松*(1.成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系,成都 610500；.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所,上海 01403)

·論 著·

基于ITS序列的紫芝分子鑒定

蘇春麗1,2,唐傳紅2,張勁松2*
(1.成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系,成都 610500；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所,上海 201403)

目的 建立基于ITS序列的紫芝分子鑒定方法。 方法 分析20株靈芝屬菌株ITS序列,設(shè)計(jì)紫芝的特異性引物。 結(jié)果 用此引物對(duì)20株靈芝屬菌株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,只有2株紫芝菌株有目的擴(kuò)增條帶。 結(jié)論 設(shè)計(jì)的特異性引物有很高的專屬性,能高度特異地鑒定紫芝菌株。

紫芝；ITS序列；分子鑒定

紫芝(Ganodermasinense)又稱黑芝、中國(guó)靈芝等,是中國(guó)特有的食藥用真菌之一。紫芝氣味甘、性溫、無毒,具有治耳聾、利關(guān)節(jié)、保神、益精氣、堅(jiān)筋骨、好顏色以及久服輕身延年不老的作用。紫芝是《中國(guó)藥典》(2010年版)記載的兩種可藥用靈芝之一,也是衛(wèi)生部發(fā)布的可用于保健食品的三種靈芝之一[1-5]。

隨著對(duì)紫芝生物學(xué)功效的不斷了解和認(rèn)識(shí),其市場(chǎng)需求也在不斷增加,紫芝原料的質(zhì)量越來越受到重視。但是由于靈芝屬菌株種類多,傳統(tǒng)鑒定主要依據(jù)形態(tài)學(xué)特征來進(jìn)行,容易出現(xiàn)混淆。

ITS是rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū),不加入成熟核糖體,受到的選擇壓力較小,進(jìn)化速度較快,在絕大多數(shù)真核生物中有著極為廣泛的序列多態(tài)性；ITS序列長(zhǎng)度適中,能從不太長(zhǎng)的序列中獲得充分的信息；同時(shí)ITS區(qū)在核基因組中是中等重復(fù)的,由于協(xié)同進(jìn)化,各重復(fù)單位高度相似或者一致,從而使得PCR產(chǎn)物可以直接測(cè)序；另外,ITS序列種內(nèi)同源性非常高,在種間又有不同程度的變異。這些優(yōu)點(diǎn)使得ITS序列成為理想的種間鑒定分子標(biāo)記,并已廣泛應(yīng)用于真菌的分子分類學(xué)、遺傳多樣性及菌株鑒定等方面的研究[6-8]。本文擬通過分析靈芝屬菌株ITS序列間的差異,設(shè)計(jì)紫芝的特異引物,建立紫芝的分子鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本研究共收集了靈芝(Ganodermalucidum)、密紋薄芝(Ganodermatenue)、紫芝(Ganodermasinense)、樹舌(Ganodermaapplanatum)、松杉樹芝(Ganodermatsugae)、近擬鹿角靈芝(Ganodermasubamboinense)、紫光靈芝(Ganodermaoerstedii)及無柄靈芝(Ganodermaresinaceum)等8個(gè)種共20株靈芝屬菌株(見表1)。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯液體培養(yǎng)基(每1 000 mL中馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g)。

1.3 主要試劑和儀器

引物(Invitrogen合成)、Taq酶(promega)、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(天為時(shí)代D2000)和PCR儀(effendorf)。

1.4 方法

1.4.1 菌絲培養(yǎng)和DNA提取方法 菌種經(jīng)活化后接種于馬鈴薯液體培養(yǎng)基中,28 ℃振蕩(150 r/ min)培養(yǎng)10～15 d,收集菌絲,-20 ℃保存?zhèn)溆?。DNA提取參照唐傳紅等[9]的方法進(jìn)行,經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試菌株

ATCC：美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心

1.4.2 ITS序列分析方法 根據(jù)Genbank中已有的靈芝屬菌株ITS序列信息,確定ITS1、ITS2和5.8S的序列范圍。依據(jù)常用的兼并堿基代碼將ITS序列中所含的雜合位點(diǎn)重新編碼,用DNAStar軟件將DNA序列轉(zhuǎn)換成FastA格式,再利用ClustalX 1.8軟件進(jìn)行排列分析。

1.4.3 DNA模板的檢驗(yàn) 用真菌ITS區(qū)通用引物ITS1F/ITS4對(duì)所有DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增,驗(yàn)證DNA的質(zhì)量能否滿足PCR反應(yīng)的要求。擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL)：10×PCR buffer 2.5 μL,MgCl2(25 mmol/L)2 μL,dNTP(10 mmol/L)0.5 μL,引物ITS1F/ITS4(10 μmol/L)各1 μL,Taq酶(5 U/μL)0.25 μL,DNA模板10 ng,用無菌雙蒸水補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共28個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

1.4.4 紫芝特異性引物的設(shè)計(jì)及驗(yàn)證 根據(jù)20個(gè)菌株ITS序列比對(duì)的結(jié)果,尋找紫芝的序列特異位點(diǎn),設(shè)計(jì)紫芝的特異性引物,進(jìn)而對(duì)所有菌株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,驗(yàn)證引物的特異性。紫芝鑒定PCR的反應(yīng)體系除引物為GS1/GS2外,其他與ITS區(qū)相同；PCR擴(kuò)增程序中的退火溫度為65 ℃,其他與ITS區(qū)相同。

2 結(jié)果

2.1 基于ITS序列設(shè)計(jì)紫芝的特異性引物

對(duì)20株靈芝屬菌株的ITS序列進(jìn)行比對(duì)分析[10,11],尋找紫芝ITS序列的特異位點(diǎn),設(shè)計(jì)出紫芝的特異引物。引物名稱與序列分別是GS1： ACG GAC TGT GGA GCG GGC TCT G；GS2：GTC ATA AGC TTT GTC TCC ATA C。

2.2 DNA模板的檢驗(yàn)

用真菌ITS區(qū)通用引物ITS1F/ITS4對(duì)所有DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增,驗(yàn)證DNA的質(zhì)量能否滿足PCR反應(yīng)的要求。結(jié)果顯示,所有菌株DNA均能擴(kuò)增出清晰的目的條帶(見圖1),表明所用的DNA能滿足PCR反應(yīng)的要求。

圖1 引物ITS1F/ITS4對(duì)20個(gè)靈芝屬菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖M：分子量標(biāo)記；CK：陰性對(duì)照；代碼 1～20：GL11、GL23、GTEN24、GL36、GL81、GA117、GL126、GL128、GL129、GT132、GSUB136、GSUB137、GO138、GR140、GR145、GL146、GA165、GL166、GS175、GS181

2.3 紫芝的PCR鑒定

用設(shè)計(jì)出的紫芝特異性引物GS1/GS2對(duì)20個(gè)靈芝屬菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增,當(dāng)退火溫度為62 ℃時(shí),紫芝菌株GS175和GS181有清晰的目的擴(kuò)增條帶,但11、12泳道的近似鹿角靈芝菌株GSUB136和GAUB137有較弱的大小約1 000 bp的非目的條帶,其他菌株均無擴(kuò)增條帶。當(dāng)退火溫度升至65 ℃時(shí),紫芝菌株GS175和GS181有清晰的目的擴(kuò)增條帶,而其他菌株均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶(見圖2)。本文設(shè)計(jì)出紫芝的特異性引物,對(duì)20株靈芝屬菌株進(jìn)行擴(kuò)增,只有2株紫芝菌株有清晰的目的條帶,其他菌株在同等PCR條件下均無擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。結(jié)果表明,本研究設(shè)計(jì)的特異性引物有很高的專屬性,能對(duì)紫芝菌株進(jìn)行分子鑒定。

圖2 引物GS1/GS2對(duì)20個(gè)靈芝屬菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖M：分子量標(biāo)記；CK：陰性對(duì)照；圖中代碼同圖1

3 討論

傳統(tǒng)的紫芝等靈芝屬菌株的鑒定主要建立在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)之上,但子實(shí)體的很多形態(tài)學(xué)特征往往因生長(zhǎng)條件的不同而發(fā)生改變,并且許多特征經(jīng)常是幾個(gè)種所共有的,這給傳統(tǒng)的紫芝鑒定帶來了很大的困難。因此,建立起不受環(huán)境因素影響,快速可靠的紫芝鑒定方法,對(duì)保證紫芝原料的質(zhì)量顯得非常迫切和必要。

分子生物學(xué)的發(fā)展,為研究者對(duì)紫芝進(jìn)行分子鑒定提供了技術(shù)支持。分子鑒定以菌株的遺傳物質(zhì)為基礎(chǔ),不受環(huán)境因素的影響,因而鑒定結(jié)果更為可靠。rDNA的ITS序列是用于探討真菌種內(nèi)變異和屬內(nèi)種間分子系統(tǒng)關(guān)系的重要分子標(biāo)記。前期研究[10]中發(fā)現(xiàn),ITS序列在靈芝屬種內(nèi)同源性非常高,但種間的同源性相對(duì)較低,說明ITS區(qū)的堿基變異為區(qū)分靈芝屬的不同種提供了充分的信息。為此,可以ITS為靶基因,建立快速鑒定紫芝菌株的特異性PCR法。

本研究通過對(duì)20株靈芝屬菌株ITS序列進(jìn)行比對(duì)分析,設(shè)計(jì)出紫芝的特異性引物,并對(duì)20株菌株進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果顯示,只有2株紫芝菌株有目的條帶,表明該方法能夠快速鑒定紫芝菌株。

研究結(jié)果表明,基于ITS序列的真菌分子鑒定技術(shù)具有準(zhǔn)確性高、特異性好和樣品需求量少的特點(diǎn),該方法易操作、成本低且實(shí)用性強(qiáng)。該鑒定技術(shù)為真菌的鑒定提供了新的思路和方法,可望為經(jīng)濟(jì)真菌的開發(fā)利用提供有益幫助。

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Molecular Detection ofGanodermasinenseBased on Nuclear Ribosomal DNA ITS Sequence

SUChun-li1,2,TANGChuan-hong2,ZHANGJing-song2*

(1.DepartmentofPublicHealth,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.InstituteofEdibleFungi,ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences,Shanghai201403,China)

Objective To build a molecular detection method to identifyGanodermasinenseisolates. Methods Based on phylogenetic analysis of rDNA ITS sequences, A pair of specific primers were designed for identifying theGanodermasinenseby PCR. Results 20 isolates ofGanodermawere amplified by the primer pairs, only twoGanodermasinenseisolates had PCR amplification products. Conclusion It is demonstrated that the primer pairs have a high specificity, and can be used to specifically identifyGanodermasinenseisolates.

Ganodermasinense; ITS Sequences; Molecular Detection

上海市農(nóng)委重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(NO：農(nóng)科攻字2002-1-4-3);成都醫(yī)學(xué)院學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(NO：CYXK2012010)

張勁松, E-mail：Zhangjs888@etang.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20140410.1540.010.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2014.02.004

R282.5

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