滕超+查沛娜+范園園+肖林+覃樹林+李秀婷

摘要：超聲波技術(shù)作為一種高效且對環(huán)境友好的制備手段，在食品加工、化工、醫(yī)療、生物工程等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，尤其通過與酶解反應(yīng)的耦合技術(shù)在生物催化領(lǐng)域得到了快速發(fā)展。就超聲場對酶解體系的作用方式、影響超聲波輔助酶解制備效果的關(guān)鍵因素以及超聲波對酶解制備可能的作用機(jī)制等方面進(jìn)行了系統(tǒng)的論述，對目前此技術(shù)的應(yīng)用情況及存在的問題進(jìn)行了分析，并對該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：超聲波；酶解制備；作用機(jī)制；耦合技術(shù)；應(yīng)用前景

中圖分類號： TS201.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0013-04

收稿日期：2013-09-05

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：31371723、31201449）。

作者簡介：滕超（1981—），男，博士，副教授，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：tengchao@th.btbu.edu.cn。

通信作者：李秀婷，博士，副教授，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c酶工程。E-mail：lixt@th.btbu.edu.cn。超聲波是指頻率高于20 kHz的聲波，它具有波動與能量的雙重屬性，屬于機(jī)械波的一種。超聲學(xué)至今已有超過100年的研究歷史，而自20世紀(jì)80年代以來相關(guān)領(lǐng)域的研究發(fā)展迅猛，超聲波除理論研究外在應(yīng)用研究領(lǐng)域也取得了較大發(fā)展。目前，超聲波技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品加工、化工、醫(yī)療、生物工程等領(lǐng)域[1-3]。超聲波與酶解反應(yīng)的耦合技術(shù)在生工產(chǎn)品制備中的應(yīng)用研究雖然起步較晚，但由于其獨(dú)特的優(yōu)勢及應(yīng)用潛力，近些年逐漸受到人們的重視。超聲波技術(shù)在酶解制備中的應(yīng)用主要是通過超聲波能量作用于反應(yīng)體系改變各個組成部分的作用方式，提高產(chǎn)物的合成效率來實(shí)現(xiàn)的。但由于酶解體系很復(fù)雜，其確切的作用機(jī)制尚需大量研究進(jìn)行驗(yàn)證，本文就超聲波對酶解產(chǎn)物制備的影響、超聲波輔助酶解制備中關(guān)鍵影響因素等進(jìn)行論述，對超聲波輔助酶解制備的應(yīng)用進(jìn)展及現(xiàn)存問題進(jìn)行介紹和分析。

1超聲波對生化反應(yīng)的一般作用機(jī)制

超聲波由于頻率相對較高而賦予其自身巨大能量。一般認(rèn)為，高頻能量使得被其輻射的分子急速運(yùn)動，并伴有顯著的聲壓作用，分子結(jié)構(gòu)也因此受到一定程度的破壞，從而直接或間接改變反應(yīng)速率。超聲波在傳播過程中與介質(zhì)相互作用引起各種超聲效應(yīng)。超聲效應(yīng)一般有熱效應(yīng)、機(jī)械傳質(zhì)作用、空化效應(yīng)等3種，而超聲波的頻率、強(qiáng)度等參數(shù)會直接影響上述3種作用的強(qiáng)弱[4]。其中，熱效應(yīng)一般會引起介質(zhì)整體或邊界外局部溫升，而空化形成激波時則會導(dǎo)致波前處的局部產(chǎn)生加熱現(xiàn)象等。超聲波的熱效應(yīng)雖然不是超聲波對生化反應(yīng)過程作用的主要方式，但現(xiàn)已確定為重要影響因素之一。其次，超聲波作為一種機(jī)械振動能量的傳播形式，可以使介質(zhì)質(zhì)點(diǎn)進(jìn)入振動狀態(tài)，從而增強(qiáng)液態(tài)介質(zhì)的質(zhì)點(diǎn)運(yùn)動，加速質(zhì)量傳遞作用，進(jìn)而在液體中形成有效的流動與攪動，導(dǎo)致介質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞，液體中的顆粒被粉碎，達(dá)到普通低頻機(jī)械攪動所達(dá)不到的效果[4]。空化作用是當(dāng)超聲波在介質(zhì)中傳播時強(qiáng)度超過了某一空氣閥值所產(chǎn)生的空化現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為液體中微小空氣泡核在超聲波作用下被激活，出現(xiàn)泡核的振蕩、生長、收縮、崩潰等一系列動力學(xué)過程。通常認(rèn)為以上超聲波所具有的效應(yīng)對生物質(zhì)提取尤其是酶催化反應(yīng)具有重要的影響。

超聲波在食品加工中的應(yīng)用主要通過上述幾種機(jī)制將聲能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能實(shí)現(xiàn)。其中，空化效應(yīng)通常被認(rèn)為在催化過程中起主要作用。根據(jù)不同的特性，空化作用又可以分為瞬態(tài)空化和穩(wěn)態(tài)空化2種。一般較高強(qiáng)度的超聲會產(chǎn)生瞬態(tài)空化作用，空化泡崩潰的瞬間，釋放出高溫高壓，導(dǎo)致大量自由基的形成，并伴有強(qiáng)大的沖擊波或射流；高能量的自由基直接攻擊酶分子發(fā)生化學(xué)變化，影響酶的活性中心，使酶活性減弱甚至失活；而酶分子在強(qiáng)大的沖擊波或射流的作用下，分子結(jié)構(gòu)被破壞甚至被剪切成小碎片而表現(xiàn)出活性減弱甚至失活的現(xiàn)象。穩(wěn)態(tài)空化作用形成的空化泡則可使其周圍的酶或細(xì)胞顆粒受微聲流作用下的切應(yīng)力作用，這種類型的空化作用同樣對超聲波在生物催化反應(yīng)中的應(yīng)用具有重要意義。

2超聲波對酶解反應(yīng)的影響

酶是一類具有生物催化活性的特殊蛋白質(zhì)，具有催化效率高、高度專一性、易調(diào)節(jié)控制等優(yōu)點(diǎn)，其應(yīng)用范圍十分廣泛。酶催化在食品工業(yè)中的應(yīng)用可以提高產(chǎn)率，降低能耗，甚至可以促進(jìn)新產(chǎn)品、新技術(shù)、新工藝的興起和發(fā)展。根據(jù)已有研究可知，眾多種類物理場對酶活性均會產(chǎn)生不同程度的影響，例如，磁場、微波、電場、超聲場等均可以不同程度地改變特定酶的性質(zhì)。酶解反應(yīng)速度通常主要取決于傳質(zhì)效率和酶分子構(gòu)象等2個因素；而超聲場則會通過加熱、機(jī)械傳質(zhì)和空化等作用機(jī)制不同程度地影響這2個因素，進(jìn)而改變酶催化反應(yīng)進(jìn)程。當(dāng)前研究已經(jīng)初步證實(shí)，超聲波可以促進(jìn)底物分子之間的相互作用，強(qiáng)化反應(yīng)物進(jìn)入及生成物離開酶活性中心的過程，提高酶的活性；另外，還可以改變細(xì)胞膜的透性，加強(qiáng)物質(zhì)傳輸，因而被廣泛用于酶解產(chǎn)物的制備過程中。

2.1超聲波對酶解底物的預(yù)處理

超聲波對底物的作用效果主要是通過提升底物的傳質(zhì)速率來實(shí)現(xiàn)的。在較低強(qiáng)度的超聲作用下，超聲還可以通過降低溶液的黏度和表面張力來增加底物的傳質(zhì)效果。另外，超聲產(chǎn)生的機(jī)械傳質(zhì)作用和加熱作用也可以增加底物分子（包括酶分子）的能量使其運(yùn)動性加強(qiáng)，增加兩者間的接觸概率。在此基礎(chǔ)上，合適的超聲場還可以加強(qiáng)介質(zhì)與酶之間的傳質(zhì)擴(kuò)散過程，超聲振動產(chǎn)生氣泡的界面不僅有利于介質(zhì)中的底物分子進(jìn)入酶活性中心，同時也可以幫助酶解產(chǎn)物進(jìn)入介質(zhì)提高酶促反應(yīng)速度。已有相關(guān)試驗(yàn)證實(shí)，較低強(qiáng)度超聲產(chǎn)生的空化泡可使附近的酶分子受到微流產(chǎn)生的切力作用，可能會對疏通酶內(nèi)外擴(kuò)散的傳質(zhì)通道有利。此外，超聲還可以使反應(yīng)生成的水再分配，避免新生成的水在酶分子表面形成較厚的水化層而影響底物分子和產(chǎn)物分子的傳質(zhì)。

何榮海等在利用超聲波輔助酶法生產(chǎn)紫菜降壓肽的研究中，采用20 kHz、800 W的超聲場對底物紫菜蛋白進(jìn)行60 min的預(yù)處理，然后再用蛋白酶水解。結(jié)果顯示，經(jīng)超聲波處理的紫菜蛋白與未處理的樣品相比，相同條件下底物蛋白水解度增加110%，同時水解產(chǎn)物活性也有所提高（IC50降低295%）[5]。Imai等在超聲輔助纖維素酶水解試驗(yàn)中也得到了類似結(jié)果，首先使用超聲波對底物（纖維素）進(jìn)行預(yù)處理而后酶解，使得酶解速度顯著提高，說明可能是超聲在改善傳質(zhì)效果的同時改變了底物分子的部分空間構(gòu)象，增強(qiáng)了底物與酶分子的結(jié)合度，加快了酶解進(jìn)程[6]。但對于不同反應(yīng)體系及超聲條件也可能會產(chǎn)生不同的作用效果，例如，林洮等在利用超聲輔助胰蛋白酶水解米渣蛋白試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用超聲波對底物蛋白溶液進(jìn)行預(yù)處理后，酶解反應(yīng)速率迅速降低；當(dāng)超聲預(yù)處理時間大于30 min時，酶解反而會被完全抑制。這可能是因?yàn)橥ㄟ^超聲波預(yù)處理使得底物蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，減少了底物與水解酶的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而降低了反應(yīng)速度[7]。

2.2超聲波對酶的預(yù)處理

酶活性的強(qiáng)弱主要取決于酶分子構(gòu)象的合理程度。超聲作用于酶分子時釋放的能量可導(dǎo)致酶分子的構(gòu)象發(fā)生一定程度的改變，從而影響到催化活性的變化。較低強(qiáng)度的超聲處理會使酶分子能量增加以及介質(zhì)發(fā)生溫升，從而引起酶分子構(gòu)象的微小變化，使酶分子的超微結(jié)構(gòu)更具柔性、更合理，進(jìn)而表現(xiàn)出較高的催化活性。如果超聲強(qiáng)度進(jìn)一步加強(qiáng)，酶分子結(jié)構(gòu)則有可能進(jìn)一步改變以趨向不合理的構(gòu)象，導(dǎo)致酶分子本身的催化活性受到阻礙，表現(xiàn)為酶失活。

Wang等用圓二色譜（CD）對纖維素酶二級結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行分析，以α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的含量來闡明二級結(jié)構(gòu)與酶活性之間的聯(lián)系[8]。如表1所示，超聲引起一定數(shù)量的α-螺旋形變和無規(guī)則卷曲含量的增加，進(jìn)而造成蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化。這些變化使纖維素酶更具柔軟性和靈活性，使底物更容易進(jìn)入纖維素酶的活性中心，這也有利于纖維素酶活性的改善。但是過量的超聲處理后，隨著α-螺旋含量的增加和無規(guī)卷曲含量的減少，纖維素酶活性減弱，這表明酶活性中心可能被較緊湊的結(jié)構(gòu)所包圍，從而阻礙底物與酶反應(yīng)。

Wang等在研究低強(qiáng)度超聲波對纖維素酶預(yù)處理的影響中，用色氨酸熒光光譜（最大熒光發(fā)射波長為348 nm）對酶構(gòu)象的變化進(jìn)行了研究[8]。相關(guān)研究表明，酶分子的熒光強(qiáng)度隨著超聲功率、超聲頻率、超聲時間的增加而逐漸減弱。這表明酶分子的構(gòu)象隨著超聲波的預(yù)處理而逐漸改變，其原因可能是超聲預(yù)處理誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子展開，破壞了蛋白質(zhì)分子的疏水相互作用，造成更多蛋白質(zhì)分子的疏水基團(tuán)暴露到外部[9-10]。

超聲波產(chǎn)生的能量可以在一定程度上改變生物大分子（如蛋白質(zhì)）結(jié)構(gòu)，因此當(dāng)適宜的超聲波作用于酶時，可改變酶分子的空間構(gòu)象使其折疊更趨合理（更易于與底物結(jié)合形成中間產(chǎn)物），從而提高酶催化效率[11]。另外也有觀點(diǎn)認(rèn)為，超聲波主要通過對酶活性部位的結(jié)合位點(diǎn)施加影響，使失去活性的酶重新具有活性或有活性的酶失活進(jìn)而改變酶解反應(yīng)表1用超聲波處理后纖維素酶的二級結(jié)構(gòu)的含量

處理方法α-螺旋含量

（%）β-折疊含量

（%）β-轉(zhuǎn)角含量

（%）無規(guī)卷曲含量

（%）酶活性

（U/mL）正常對照組26.226.621.924.850.42±1.7518 kHz、5 W超聲處理5 min23.925.023.730.452.21±1.3824 kHz、15 W超聲處理10 min23.425.023.732.159.58±1.4426 kHz、20 W超聲處理10 min24.824.622.826.954.77±1.7129 kHz、50 W超聲處理30 min27.626.423.522.231.62±4.23

進(jìn)程[12]。在作用方式方面，超聲波對酶的影響主要取決于超聲頻率、反應(yīng)介質(zhì)含水量以及介質(zhì)的疏水性等。在低強(qiáng)度及適宜的頻率下，通過超聲波的空穴作用、磁致伸縮作用和機(jī)械振蕩作用表現(xiàn)出對生化反應(yīng)的促進(jìn)功能或是對酶催化的協(xié)同加速作用。

2.3超聲作用于酶解體系

如果在酶解反應(yīng)發(fā)生時對整個體系施加超聲，首先超聲波熱效應(yīng)可以提高反應(yīng)體系溫度，在一定程度上能促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。另外，當(dāng)超聲波振動時通過能量的傳遞引起媒質(zhì)質(zhì)點(diǎn)以極高的速度和加速度進(jìn)入振動狀態(tài)，也可以在一定程度上增加酶與底物的接觸機(jī)會，進(jìn)而改變酶解反應(yīng)的進(jìn)程。

林洮等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用超聲對底物蛋白和水解酶的混合液直接處理時，試驗(yàn)組底物的分解率比對照組高；但隨著時間的延長，試驗(yàn)組底物最終分解率并沒有提高。此結(jié)果可能是溫升及蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化等因素導(dǎo)致的綜合效果[7]。丁青芝等以雙低菜籽餅粕蛋白為原料，分別考察了超聲預(yù)處理蛋白酶、超聲預(yù)處理蛋白原料和酶解過程前期施加超聲等3種超聲處理方式對該蛋白酶解制備ACEI活性肽的影響。結(jié)果顯示，以上3種超聲輔助方式都可以明顯促進(jìn)菜籽餅粕蛋白的酶解效率，而其中超聲預(yù)處理蛋白原料效果最明顯。可能是因?yàn)槌暡▽Ψ磻?yīng)底物的均質(zhì)作用起到了主要作用，通過超聲對底物的預(yù)處理增加了酶與底物的接觸面積，從而促進(jìn)了酶解反應(yīng)的進(jìn)行[13]。

3影響超聲波耦合酶解效果的主要因素

超聲波與酶解反應(yīng)的耦合作用機(jī)理較復(fù)雜，超聲處理的強(qiáng)度及其他反應(yīng)條件的差異均會對包括催化酶構(gòu)象、底物均質(zhì)、反應(yīng)體系的溫升等方面產(chǎn)生復(fù)合影響；另外，酶種類的差異、反應(yīng)體系的不同均會對超聲條件的選擇產(chǎn)生直接影響[6]。因此，要達(dá)到促進(jìn)酶解效果的目的，必須根據(jù)具體情況對超聲條件進(jìn)行系統(tǒng)考察。

3.1超聲溫度對酶解反應(yīng)的影響

通常大多數(shù)酶的活性在最適溫度范圍內(nèi)最強(qiáng)，酶促反應(yīng)速度最大。而超聲波作為一種能量形式具有加熱作用和空化作用，因此對酶反應(yīng)可產(chǎn)生促進(jìn)和抑制的雙重作用。當(dāng)溫度較低時，與空化作用相比，加熱作用占主導(dǎo)地位，超聲場下的反應(yīng)體系吸收超聲波能量，從而加速了酶促水解反應(yīng)，表現(xiàn)為促進(jìn)作用。隨著溫度的升高，空化作用逐步顯現(xiàn)，一方面，當(dāng)溫度超過特定值時，由于酶本身發(fā)生熱變性導(dǎo)致反應(yīng)速率降低[14]；另一方面，由于空化作用在液體介質(zhì)中微泡的形成和破裂并伴隨能量的釋放，在此過程中會產(chǎn)生瞬時局部高溫、高壓，同時可能伴有自由基（如水分子電離產(chǎn)生的 H·和OH·自由基）的形成，這些自由基可進(jìn)入酶活性中心破壞酶分子的構(gòu)象，進(jìn)而降低反應(yīng)速率，表現(xiàn)為抑制作用。

劉振家等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)超聲溫度小于40 ℃時，酶解制備的抗氧化肽1，1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）清除率隨著溫度的升高而逐漸升高；在40 ℃時，DPPH清除率達(dá)到最大；超過40 ℃后，DPPH清除率呈明顯下降趨勢[15]。李利軍等在對超聲波對酶法水解絲素作用的研究中發(fā)現(xiàn)，在其他條件相同的情況下分別在30～50 ℃下進(jìn)行超聲處理，結(jié)果顯示，在45 ℃時產(chǎn)物得率最高。說明合適的反應(yīng)溫度有利于超聲耦合酶解反應(yīng)的進(jìn)行[16]。

3.2超聲時間對酶解反應(yīng)的影響

超聲時間的長短主要會影響超聲空化效應(yīng)的產(chǎn)生和持續(xù)。劉振家等以抗氧化肽粗品清除DPPH的能力為指標(biāo)研究超聲時間對酶解脫脂小麥胚芽制備抗氧化肽的影響，結(jié)果顯示，抗氧化肽的DPPH清除率隨著耦合超聲時間的延長逐漸升高，至3 min時達(dá)到最大；超過3 min后，酶解產(chǎn)物的清除率并沒有隨時間的延長而明顯升高[15]。另外，還有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在超聲作用過程中，產(chǎn)物活性略有下降，這可能是由于超聲過程的熱效應(yīng)以及剪切力抑制了酶的活性[17]。楊柳等也發(fā)現(xiàn)，通過水酶法提取大豆油產(chǎn)物制備得率隨超聲時間的延長而升高，超聲15 min后漸趨穩(wěn)定，即繼續(xù)延長超聲時間制備得率保持不變[18]。

3.3超聲波強(qiáng)度對酶解反應(yīng)的影響

莫英杰等在超聲輔助酶法制備大蒜素的研究中考察了不同超聲強(qiáng)度（0.1～0.4 W/cm2）對大蒜素得率的影響，結(jié)果顯示，大蒜素得率隨超聲強(qiáng)度的升高而升高，當(dāng)強(qiáng)度為 0.4 W/cm2 時，大蒜素的得率最高[19]；但武赟等在超聲波輔助酶解制備多孔淀粉的研究發(fā)現(xiàn)，酶解過程中較高強(qiáng)度的超聲波處理反而降低水解率[20]。可能是因?yàn)檩^高強(qiáng)度的超聲波會使酶中氫鍵斷裂，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)展開；另外，超聲過程中產(chǎn)生的OH-具有很強(qiáng)的氧化作用，能與酶中的氨基酸結(jié)合反應(yīng)，致使酶失活降低水解率[21]。

3.4超聲頻率對酶解反應(yīng)的影響

李利軍等在對超聲波對酶法水解絲素的研究中發(fā)現(xiàn)，不同頻率超聲波對堿性蛋白酶水解再生絲素液作用不同。在其他條件相同的情況下，分別用頻率為 26、48、69 kHz超聲處理，結(jié)果顯示，超聲頻率為 26 kHz時，產(chǎn)物回收率最高。說明低頻超聲有利于提升酶解反應(yīng)效果[16]。莫英杰等在超聲輔助酶法制備大蒜素研究中考察的超聲頻率區(qū)段為 28～135 kHz，大蒜素得率隨超聲酶解頻率的增加呈現(xiàn)出先增后降的趨勢，當(dāng)超聲頻率為 50 kHz 時，大蒜素的得率最高?？赡苁且?yàn)殡S著超聲頻率的增加，酶和底物分子的碰撞頻率也增大，反應(yīng)速度加快；而當(dāng)超聲頻率繼續(xù)增大時，酶分子構(gòu)象可能會進(jìn)一步發(fā)生改變，酶活性反而降低，影響了產(chǎn)物的生成[19]。

3.5超聲功率對酶解反應(yīng)的影響

與其他超聲條件類似，超聲功率對酶解反應(yīng)同樣具有雙重效應(yīng)。李利軍等發(fā)現(xiàn)，不同功率的超聲波（110～290 W）對酶解絲素蛋白作用效果存在明顯差異，結(jié)果顯示，產(chǎn)物回收率在超聲功率為200 W 時最大[16]。丁莉莎等也有類似發(fā)現(xiàn)，通過考察不同超聲功率（0、200、250、300 W）對酪蛋白水解效果的影響發(fā)現(xiàn)，在超聲功率為200 W時，產(chǎn)物酪蛋白磷酸肽得率最高；而在超聲功率為300W時，產(chǎn)物得率甚至低于無超聲耦合的空白對照組[22]。此外，對于不同反應(yīng)相的水解反應(yīng)似乎也存在類似規(guī)律。楊柳等在用水酶法提取大豆油的研究中發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)過程中耦合的超聲場產(chǎn)物提取率隨著功率增大相應(yīng)提高，當(dāng)功率達(dá)到400 W時，提取率最高，為85.54%；而當(dāng)功率超過400 W后，提取率反而減小。可能是由于功率過大導(dǎo)致超聲瞬間熱效應(yīng)過于明顯，使得局部溫度過高，導(dǎo)致原料中蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而影響油脂溶出[18]。

4展望

當(dāng)前國內(nèi)外相關(guān)研究已經(jīng)充分證明，超聲技術(shù)在包括酶解制備等生物催化領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。相關(guān)工作已經(jīng)在理論研究及應(yīng)用推廣領(lǐng)域廣泛展開，并逐漸將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到對其核心規(guī)律或理論的發(fā)掘和論證上。但由于生物催化反應(yīng)體系本身的復(fù)雜性以及對超聲化學(xué)認(rèn)識的限制，很多本質(zhì)的機(jī)理性問題遠(yuǎn)未得到明確闡釋和說明。而先前未重點(diǎn)考察的影響因素最近被證實(shí)同樣可能會對反應(yīng)效果產(chǎn)生顯著影響，例如，對于部分酶解試驗(yàn)采用復(fù)頻共振的方式明顯優(yōu)于單一頻率的提取率[22-23]，占空比對超聲提取率及提取物的純度可能會存在一定影響。另外，目前超聲提取設(shè)備基本都是通過介質(zhì)（一般為水）將超聲間接作用于樣品，而為提高超聲波作用效率可進(jìn)一步開發(fā)能滿足復(fù)頻、占空比等研究需要的制備儀器等。隨著對超聲耦合酶解體系研究的逐步全面和深入，很多深層次的問題包括超聲與各類反應(yīng)體系影響關(guān)系的分析、相關(guān)反應(yīng)模型的確定等核心規(guī)律問題有望逐漸得到涉及和明確，從而可以有效推進(jìn)該項(xiàng)技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1]Cocciardi R A，Ismail A A，Sedman J. Investigation of the potential utility of single-bounce attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy in the analysis of distilled liquors and wines[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53（8）：2803-2809.

[2]Mitragotr S，Kost J. Low-frequency sonophoresis：a review[J]. Advanced Drug Delivery Reviews，2004，56（5）：589-601.

[3]Coupland J N. Low intensity ultrasound[J]. Food Research International，2004，37（6）：537-543.

[4]Patist A，Bates D. Ultrasonic innovations in the food industry：from the laboratory to commercial production[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies，2008，9（2）：147-154.

[5]何榮海，馬海樂，周存山，等. 超聲波在酶法生產(chǎn)紫菜降血壓肽過程中的應(yīng)用[J]. 江蘇大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2007，28（1）：4-7.

[6]Imai M，Ikari K，Suzuki I. High-performance hydrolysis of cellulose using mixed cellulase species and ultrasounication pretreatment[J]. Biochemistry Engineering Journal，2004，17（2）：79-83.

[7]林洮，江漓，趙小虎，等. 超聲促進(jìn)胰蛋白酶酶解米渣蛋白的研究[J]. 食品研究與開發(fā)，2012，33（3）：6-9.

[8]Wang Z B，Lin X M，Li P P，et al. Effects of low intensity ultrasound on cellulase pretreatment[J]. Bioresource Technology，2012，117：222-227.

[9]Gülseren I，Güzey D，Bruce B D，et al. Structural and functional changes in ultrasonicated bovine serum albumin solutions[J]. Ultrasonics Sonochemistry，2007，14（2）：173-183.

[10]Jambrak A R，Mason T J，Lelas V，et al. Effect of ultrasound treatment on solubility and foaming properties of whey protein suspensions[J]. Journal of Food Engineering，2008，86（2）：281-287.

[11]李慧，金仁哲，劉振春，等. 超聲波對雙酶水解玉米蛋白的影響[J].

3.2超聲時間對酶解反應(yīng)的影響

超聲時間的長短主要會影響超聲空化效應(yīng)的產(chǎn)生和持續(xù)。劉振家等以抗氧化肽粗品清除DPPH的能力為指標(biāo)研究超聲時間對酶解脫脂小麥胚芽制備抗氧化肽的影響，結(jié)果顯示，抗氧化肽的DPPH清除率隨著耦合超聲時間的延長逐漸升高，至3 min時達(dá)到最大；超過3 min后，酶解產(chǎn)物的清除率并沒有隨時間的延長而明顯升高[15]。另外，還有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在超聲作用過程中，產(chǎn)物活性略有下降，這可能是由于超聲過程的熱效應(yīng)以及剪切力抑制了酶的活性[17]。楊柳等也發(fā)現(xiàn)，通過水酶法提取大豆油產(chǎn)物制備得率隨超聲時間的延長而升高，超聲15 min后漸趨穩(wěn)定，即繼續(xù)延長超聲時間制備得率保持不變[18]。

3.3超聲波強(qiáng)度對酶解反應(yīng)的影響

莫英杰等在超聲輔助酶法制備大蒜素的研究中考察了不同超聲強(qiáng)度（0.1～0.4 W/cm2）對大蒜素得率的影響，結(jié)果顯示，大蒜素得率隨超聲強(qiáng)度的升高而升高，當(dāng)強(qiáng)度為 0.4 W/cm2 時，大蒜素的得率最高[19]；但武赟等在超聲波輔助酶解制備多孔淀粉的研究發(fā)現(xiàn)，酶解過程中較高強(qiáng)度的超聲波處理反而降低水解率[20]?？赡苁且?yàn)檩^高強(qiáng)度的超聲波會使酶中氫鍵斷裂，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)展開；另外，超聲過程中產(chǎn)生的OH-具有很強(qiáng)的氧化作用，能與酶中的氨基酸結(jié)合反應(yīng)，致使酶失活降低水解率[21]。

3.4超聲頻率對酶解反應(yīng)的影響

李利軍等在對超聲波對酶法水解絲素的研究中發(fā)現(xiàn)，不同頻率超聲波對堿性蛋白酶水解再生絲素液作用不同。在其他條件相同的情況下，分別用頻率為 26、48、69 kHz超聲處理，結(jié)果顯示，超聲頻率為 26 kHz時，產(chǎn)物回收率最高。說明低頻超聲有利于提升酶解反應(yīng)效果[16]。莫英杰等在超聲輔助酶法制備大蒜素研究中考察的超聲頻率區(qū)段為 28～135 kHz，大蒜素得率隨超聲酶解頻率的增加呈現(xiàn)出先增后降的趨勢，當(dāng)超聲頻率為 50 kHz 時，大蒜素的得率最高?？赡苁且?yàn)殡S著超聲頻率的增加，酶和底物分子的碰撞頻率也增大，反應(yīng)速度加快；而當(dāng)超聲頻率繼續(xù)增大時，酶分子構(gòu)象可能會進(jìn)一步發(fā)生改變，酶活性反而降低，影響了產(chǎn)物的生成[19]。

3.5超聲功率對酶解反應(yīng)的影響

與其他超聲條件類似，超聲功率對酶解反應(yīng)同樣具有雙重效應(yīng)。李利軍等發(fā)現(xiàn)，不同功率的超聲波（110～290 W）對酶解絲素蛋白作用效果存在明顯差異，結(jié)果顯示，產(chǎn)物回收率在超聲功率為200 W 時最大[16]。丁莉莎等也有類似發(fā)現(xiàn)，通過考察不同超聲功率（0、200、250、300 W）對酪蛋白水解效果的影響發(fā)現(xiàn)，在超聲功率為200 W時，產(chǎn)物酪蛋白磷酸肽得率最高；而在超聲功率為300W時，產(chǎn)物得率甚至低于無超聲耦合的空白對照組[22]。此外，對于不同反應(yīng)相的水解反應(yīng)似乎也存在類似規(guī)律。楊柳等在用水酶法提取大豆油的研究中發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)過程中耦合的超聲場產(chǎn)物提取率隨著功率增大相應(yīng)提高，當(dāng)功率達(dá)到400 W時，提取率最高，為85.54%；而當(dāng)功率超過400 W后，提取率反而減小?？赡苁怯捎诠β蔬^大導(dǎo)致超聲瞬間熱效應(yīng)過于明顯，使得局部溫度過高，導(dǎo)致原料中蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而影響油脂溶出[18]。

4展望

當(dāng)前國內(nèi)外相關(guān)研究已經(jīng)充分證明，超聲技術(shù)在包括酶解制備等生物催化領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。相關(guān)工作已經(jīng)在理論研究及應(yīng)用推廣領(lǐng)域廣泛展開，并逐漸將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到對其核心規(guī)律或理論的發(fā)掘和論證上。但由于生物催化反應(yīng)體系本身的復(fù)雜性以及對超聲化學(xué)認(rèn)識的限制，很多本質(zhì)的機(jī)理性問題遠(yuǎn)未得到明確闡釋和說明。而先前未重點(diǎn)考察的影響因素最近被證實(shí)同樣可能會對反應(yīng)效果產(chǎn)生顯著影響，例如，對于部分酶解試驗(yàn)采用復(fù)頻共振的方式明顯優(yōu)于單一頻率的提取率[22-23]，占空比對超聲提取率及提取物的純度可能會存在一定影響。另外，目前超聲提取設(shè)備基本都是通過介質(zhì)（一般為水）將超聲間接作用于樣品，而為提高超聲波作用效率可進(jìn)一步開發(fā)能滿足復(fù)頻、占空比等研究需要的制備儀器等。隨著對超聲耦合酶解體系研究的逐步全面和深入，很多深層次的問題包括超聲與各類反應(yīng)體系影響關(guān)系的分析、相關(guān)反應(yīng)模型的確定等核心規(guī)律問題有望逐漸得到涉及和明確，從而可以有效推進(jìn)該項(xiàng)技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1]Cocciardi R A，Ismail A A，Sedman J. Investigation of the potential utility of single-bounce attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy in the analysis of distilled liquors and wines[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53（8）：2803-2809.

[2]Mitragotr S，Kost J. Low-frequency sonophoresis：a review[J]. Advanced Drug Delivery Reviews，2004，56（5）：589-601.

[3]Coupland J N. Low intensity ultrasound[J]. Food Research International，2004，37（6）：537-543.

[4]Patist A，Bates D. Ultrasonic innovations in the food industry：from the laboratory to commercial production[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies，2008，9（2）：147-154.

[5]何榮海，馬海樂，周存山，等. 超聲波在酶法生產(chǎn)紫菜降血壓肽過程中的應(yīng)用[J]. 江蘇大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2007，28（1）：4-7.

[6]Imai M，Ikari K，Suzuki I. High-performance hydrolysis of cellulose using mixed cellulase species and ultrasounication pretreatment[J]. Biochemistry Engineering Journal，2004，17（2）：79-83.

[7]林洮，江漓，趙小虎，等. 超聲促進(jìn)胰蛋白酶酶解米渣蛋白的研究[J]. 食品研究與開發(fā)，2012，33（3）：6-9.

[8]Wang Z B，Lin X M，Li P P，et al. Effects of low intensity ultrasound on cellulase pretreatment[J]. Bioresource Technology，2012，117：222-227.

[9]Gülseren I，Güzey D，Bruce B D，et al. Structural and functional changes in ultrasonicated bovine serum albumin solutions[J]. Ultrasonics Sonochemistry，2007，14（2）：173-183.

[10]Jambrak A R，Mason T J，Lelas V，et al. Effect of ultrasound treatment on solubility and foaming properties of whey protein suspensions[J]. Journal of Food Engineering，2008，86（2）：281-287.

[11]李慧，金仁哲，劉振春，等. 超聲波對雙酶水解玉米蛋白的影響[J].

3.2超聲時間對酶解反應(yīng)的影響

超聲時間的長短主要會影響超聲空化效應(yīng)的產(chǎn)生和持續(xù)。劉振家等以抗氧化肽粗品清除DPPH的能力為指標(biāo)研究超聲時間對酶解脫脂小麥胚芽制備抗氧化肽的影響，結(jié)果顯示，抗氧化肽的DPPH清除率隨著耦合超聲時間的延長逐漸升高，至3 min時達(dá)到最大；超過3 min后，酶解產(chǎn)物的清除率并沒有隨時間的延長而明顯升高[15]。另外，還有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在超聲作用過程中，產(chǎn)物活性略有下降，這可能是由于超聲過程的熱效應(yīng)以及剪切力抑制了酶的活性[17]。楊柳等也發(fā)現(xiàn)，通過水酶法提取大豆油產(chǎn)物制備得率隨超聲時間的延長而升高，超聲15 min后漸趨穩(wěn)定，即繼續(xù)延長超聲時間制備得率保持不變[18]。

3.3超聲波強(qiáng)度對酶解反應(yīng)的影響

莫英杰等在超聲輔助酶法制備大蒜素的研究中考察了不同超聲強(qiáng)度（0.1～0.4 W/cm2）對大蒜素得率的影響，結(jié)果顯示，大蒜素得率隨超聲強(qiáng)度的升高而升高，當(dāng)強(qiáng)度為 0.4 W/cm2 時，大蒜素的得率最高[19]；但武赟等在超聲波輔助酶解制備多孔淀粉的研究發(fā)現(xiàn)，酶解過程中較高強(qiáng)度的超聲波處理反而降低水解率[20]?？赡苁且?yàn)檩^高強(qiáng)度的超聲波會使酶中氫鍵斷裂，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)展開；另外，超聲過程中產(chǎn)生的OH-具有很強(qiáng)的氧化作用，能與酶中的氨基酸結(jié)合反應(yīng)，致使酶失活降低水解率[21]。

3.4超聲頻率對酶解反應(yīng)的影響

李利軍等在對超聲波對酶法水解絲素的研究中發(fā)現(xiàn)，不同頻率超聲波對堿性蛋白酶水解再生絲素液作用不同。在其他條件相同的情況下，分別用頻率為 26、48、69 kHz超聲處理，結(jié)果顯示，超聲頻率為 26 kHz時，產(chǎn)物回收率最高。說明低頻超聲有利于提升酶解反應(yīng)效果[16]。莫英杰等在超聲輔助酶法制備大蒜素研究中考察的超聲頻率區(qū)段為 28～135 kHz，大蒜素得率隨超聲酶解頻率的增加呈現(xiàn)出先增后降的趨勢，當(dāng)超聲頻率為 50 kHz 時，大蒜素的得率最高?？赡苁且?yàn)殡S著超聲頻率的增加，酶和底物分子的碰撞頻率也增大，反應(yīng)速度加快；而當(dāng)超聲頻率繼續(xù)增大時，酶分子構(gòu)象可能會進(jìn)一步發(fā)生改變，酶活性反而降低，影響了產(chǎn)物的生成[19]。

3.5超聲功率對酶解反應(yīng)的影響

與其他超聲條件類似，超聲功率對酶解反應(yīng)同樣具有雙重效應(yīng)。李利軍等發(fā)現(xiàn)，不同功率的超聲波（110～290 W）對酶解絲素蛋白作用效果存在明顯差異，結(jié)果顯示，產(chǎn)物回收率在超聲功率為200 W 時最大[16]。丁莉莎等也有類似發(fā)現(xiàn)，通過考察不同超聲功率（0、200、250、300 W）對酪蛋白水解效果的影響發(fā)現(xiàn)，在超聲功率為200 W時，產(chǎn)物酪蛋白磷酸肽得率最高；而在超聲功率為300W時，產(chǎn)物得率甚至低于無超聲耦合的空白對照組[22]。此外，對于不同反應(yīng)相的水解反應(yīng)似乎也存在類似規(guī)律。楊柳等在用水酶法提取大豆油的研究中發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)過程中耦合的超聲場產(chǎn)物提取率隨著功率增大相應(yīng)提高，當(dāng)功率達(dá)到400 W時，提取率最高，為85.54%；而當(dāng)功率超過400 W后，提取率反而減小?？赡苁怯捎诠β蔬^大導(dǎo)致超聲瞬間熱效應(yīng)過于明顯，使得局部溫度過高，導(dǎo)致原料中蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而影響油脂溶出[18]。

4展望

當(dāng)前國內(nèi)外相關(guān)研究已經(jīng)充分證明，超聲技術(shù)在包括酶解制備等生物催化領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。相關(guān)工作已經(jīng)在理論研究及應(yīng)用推廣領(lǐng)域廣泛展開，并逐漸將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到對其核心規(guī)律或理論的發(fā)掘和論證上。但由于生物催化反應(yīng)體系本身的復(fù)雜性以及對超聲化學(xué)認(rèn)識的限制，很多本質(zhì)的機(jī)理性問題遠(yuǎn)未得到明確闡釋和說明。而先前未重點(diǎn)考察的影響因素最近被證實(shí)同樣可能會對反應(yīng)效果產(chǎn)生顯著影響，例如，對于部分酶解試驗(yàn)采用復(fù)頻共振的方式明顯優(yōu)于單一頻率的提取率[22-23]，占空比對超聲提取率及提取物的純度可能會存在一定影響。另外，目前超聲提取設(shè)備基本都是通過介質(zhì)（一般為水）將超聲間接作用于樣品，而為提高超聲波作用效率可進(jìn)一步開發(fā)能滿足復(fù)頻、占空比等研究需要的制備儀器等。隨著對超聲耦合酶解體系研究的逐步全面和深入，很多深層次的問題包括超聲與各類反應(yīng)體系影響關(guān)系的分析、相關(guān)反應(yīng)模型的確定等核心規(guī)律問題有望逐漸得到涉及和明確，從而可以有效推進(jìn)該項(xiàng)技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1]Cocciardi R A，Ismail A A，Sedman J. Investigation of the potential utility of single-bounce attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy in the analysis of distilled liquors and wines[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53（8）：2803-2809.

[2]Mitragotr S，Kost J. Low-frequency sonophoresis：a review[J]. Advanced Drug Delivery Reviews，2004，56（5）：589-601.

[3]Coupland J N. Low intensity ultrasound[J]. Food Research International，2004，37（6）：537-543.

[4]Patist A，Bates D. Ultrasonic innovations in the food industry：from the laboratory to commercial production[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies，2008，9（2）：147-154.

[5]何榮海，馬海樂，周存山，等. 超聲波在酶法生產(chǎn)紫菜降血壓肽過程中的應(yīng)用[J]. 江蘇大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2007，28（1）：4-7.

[6]Imai M，Ikari K，Suzuki I. High-performance hydrolysis of cellulose using mixed cellulase species and ultrasounication pretreatment[J]. Biochemistry Engineering Journal，2004，17（2）：79-83.

[7]林洮，江漓，趙小虎，等. 超聲促進(jìn)胰蛋白酶酶解米渣蛋白的研究[J]. 食品研究與開發(fā)，2012，33（3）：6-9.

[8]Wang Z B，Lin X M，Li P P，et al. Effects of low intensity ultrasound on cellulase pretreatment[J]. Bioresource Technology，2012，117：222-227.

[9]Gülseren I，Güzey D，Bruce B D，et al. Structural and functional changes in ultrasonicated bovine serum albumin solutions[J]. Ultrasonics Sonochemistry，2007，14（2）：173-183.

[10]Jambrak A R，Mason T J，Lelas V，et al. Effect of ultrasound treatment on solubility and foaming properties of whey protein suspensions[J]. Journal of Food Engineering，2008，86（2）：281-287.

[11]李慧，金仁哲，劉振春，等. 超聲波對雙酶水解玉米蛋白的影響[J].