王麗萍， 范 妤， 韓 曼

(1河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，河北 唐山 063000; 2陜西中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712021)

心肌重構(gòu)是各種心臟疾病中重要的病理生理改變，與高血壓、心肌梗死、病毒性心肌炎及多種心肌病等密切相關(guān)，最終誘導(dǎo)心力衰竭的發(fā)生，但其機(jī)制至今尚未完全闡明。研究顯示，由NADPH氧化酶(NADPHoxidase，Nox)誘導(dǎo)的心肌活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)增多，可激活多種與心肌重構(gòu)有關(guān)的信號(hào)激酶和轉(zhuǎn)錄因子，刺激心肌成纖維細(xì)胞增殖，同時(shí)激活基質(zhì)金屬蛋白酶，引起細(xì)胞外基質(zhì)重塑，在心臟肥大和心肌成纖維細(xì)胞增殖最終導(dǎo)致心肌重構(gòu)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1-2]。

促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)是由腎臟分泌的一種富含唾液酸的糖蛋白，屬于造血生長(zhǎng)因子家族。EPO不僅具有促進(jìn)紅細(xì)胞生成的作用，大量研究已證實(shí)，EPO還可作為一種保護(hù)因子，在心臟[3-4]、腦[5-6]、腎和肝臟[7]等多種組織及器官中發(fā)揮重要的細(xì)胞保護(hù)作用。但其在心臟保護(hù)作用中與氧化應(yīng)激的關(guān)系還未見(jiàn)明確報(bào)道。

本研究在觀(guān)察EPO對(duì)壓力超負(fù)荷所致的大鼠心功能、心肌纖維化變化影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究EPO對(duì)壓力超負(fù)荷所致的大鼠心肌NADPH氧化酶表達(dá)的影響，探討EPO的心肌保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

10～12周雄性SD大鼠，體重220～250 g，由陜西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)注射液購(gòu)自北京四環(huán)生物制藥股份有限公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒購(gòu)自Fermentas； Trizol reagent購(gòu)自Invitrogen；Western blotting 相關(guān)試劑購(gòu)自 Amresco；Masson染液購(gòu)自南京建成生物有限公司；兔抗Nox2、Nox4多克隆抗體購(gòu)自Sigma；兔抗CD45、F4/80、TGF-β多克隆抗體購(gòu)自Abcam。

2 建立壓力超負(fù)荷動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)分組

腹腔注射戊巴比妥鈉(15 mg/kg)麻醉動(dòng)物后固定，分離腹主動(dòng)脈并于動(dòng)脈下方穿線(xiàn)，將腹主動(dòng)脈與一根10號(hào)針頭一起結(jié)扎，扎緊后將針頭抽出，使腹主動(dòng)脈形成環(huán)形縮窄。檢查結(jié)扎處搏動(dòng)正常、腹后壁無(wú)出血后逐層縫合腹壁。每只肌注青、鏈霉素各5×104U，預(yù)防感染。假手術(shù)組除不結(jié)扎腹主動(dòng)脈外，其余操作均同手術(shù)組。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。

將動(dòng)物隨機(jī)分為3組，每組12只：腹主動(dòng)脈縮窄組(model)；假手術(shù)組(sham)； 重組人促紅細(xì)胞生成素組(EPO)：腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)前1 h給予重組人促紅細(xì)胞生成素，腹腔注射4 000 U/kg溶于0.5 mL生理鹽水，術(shù)后每周2次進(jìn)行注射。Sham 組及model組分別給予注射等量生理鹽水。8周后測(cè)量各組動(dòng)物體重，并對(duì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

3 主要實(shí)驗(yàn)方法和測(cè)定指標(biāo)

3.1血壓的測(cè)定 無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈血壓儀測(cè)量各組動(dòng)物血壓。通過(guò)USB接口將血壓儀主機(jī)與電腦相連，接通電源，使保溫器溫度維持于37 ℃。將大鼠尾根部放入加壓感應(yīng)器中，當(dāng)血壓計(jì)感應(yīng)到適當(dāng)?shù)氖笪惭鳡顟B(tài)時(shí)，則開(kāi)始自動(dòng)測(cè)量，所測(cè)數(shù)值和感應(yīng)波形自動(dòng)存儲(chǔ)于電腦。

3.2心臟超聲心動(dòng)圖 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉動(dòng)物，使用HpSonos 2500型多功能超聲檢查儀及7.5 MHz相控陣探頭(HD)檢測(cè)左室收縮末內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter，LVEDD)和舒張末內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVESD)，計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)和短軸縮短率(left ventricular fractional shor-tening，LVFS)。

3.3血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定 記錄左室收縮末壓(leftventricularend-systolicpressure，LVESP)、左室舒張末壓(leftventricularend-diastolicpressure，LVEDP)及左室內(nèi)壓最大上升、下降速率(maximalpositive/negativefillingpressurechangeversustime，±dp/dtmax)

3.4心肌肥大指數(shù)測(cè)定 摘取各組動(dòng)物心臟，稱(chēng)取全心重和左心室重，計(jì)算左心室重與體重的比值即為心肌肥大指數(shù)。

3.5觀(guān)察心肌纖維化程度 取左心室肌組織制成石蠟切片，進(jìn)行Masson染色。觀(guān)察各組動(dòng)物心肌間質(zhì)及血管周?chē)w維化的改變。

3.6實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)各組大鼠心肌組織Nox2和Nox4 mRNA表達(dá)的變化 采用Trizol法提取心肌組織中的總RNA，用核酸蛋白分析儀測(cè)定其純度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，取2 μg總RNA樣本于10 μL體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，20 μL 體系中進(jìn)行擴(kuò)增。

3.7Westernblotting法檢測(cè)各組大鼠心肌Nox2和Nox4蛋白表達(dá)的變化 取100mg心肌組織裂解提取總蛋白。10%SDS-PAGE分離蛋白，300mA轉(zhuǎn)膜2h將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。1% 牛血清白蛋白封閉1h。滴加Ⅰ抗(anti-Nox2和anti-Nox4)后，4 ℃過(guò)夜。將膜放入密封袋中加Ⅱ抗，室溫?fù)u床上輕搖1h，化學(xué)發(fā)光試劑放射自顯影。Westernblotting法檢測(cè)各組大鼠心室肌炎癥因子CD45、F4/80和TGF-β表達(dá)變化的方法同上。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較使用Bonferroni檢驗(yàn)。SigmaPlot 9.0軟件做統(tǒng)計(jì)圖。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 血壓和心肌肥厚指標(biāo)的測(cè)定

術(shù)后8周sham組血壓為(101.97±11.24) mmHg，model組為(201.03±14.63) mmHg，較sham組明顯升高(P<0.01)；測(cè)定各組大鼠左心室重與體重的比值，結(jié)果顯示，model組(4.97±0.72)較sham 組(1.99±0.07)明顯升高(P<0.01)，證明造模成功。結(jié)果還顯示，EPO組血壓為(131.19 ±21.32) mmHg，左心室重與體重的比值為2.23±0.76，均比model組下降(P<0.05)，說(shuō)明EPO的治療可改善壓力超負(fù)荷大鼠的血壓及心肌肥厚改變。

2 超聲心動(dòng)圖測(cè)定心功能的變化

超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示，與sham 組相比，model組大鼠的LVEF和LVFS均降低(P<0.01)，LVEDD和LVESD升高(P<0.01)；而與model組相比，EPO組的LVEF和LVFS明顯升高(P<0.01)，LVEDD和LVESD明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 超聲心動(dòng)圖指標(biāo)測(cè)定

##P<0.01vssham;*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

3 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的變化

血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)顯示，與sham組比較，model組大鼠心臟的±dp/dtmax和LVESP明顯降低(P<0.01)，LVEDP升高(P<0.01)；而EPO的使用能明顯逆轉(zhuǎn)這一改變，見(jiàn)表2。結(jié)合超聲心動(dòng)圖結(jié)果表明，EPO能明顯改善壓力超負(fù)荷所致大鼠心功能的變化。

表2 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測(cè)定

##P<0.01vssham;**P<0.01vsmodel.

4 心肌纖維化的改變

如圖1所示，sham組大鼠心肌血管周?chē)图?xì)胞間有少量的膠原纖維，形似蜂窩；model組大鼠的心肌膠原纖維含量與sham組相比顯著增加(P<0.01)，分布彌散，排列紊亂。EPO組大鼠心肌膠原纖維含量較model組明顯減少(P<0.01)。這一結(jié)果表明：EPO能抑制壓力超負(fù)荷大鼠心肌膠原的沉積。

5 心室肌Nox2和Nox4mRNA及蛋白表達(dá)的變化

實(shí)時(shí)定量PCR 及Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，model組大鼠心肌中的Nox2和Nox4 mRNA及蛋白表達(dá)較sham組明顯升高(P<0.05 或P<0.01)，使用EPO治療可顯著降低壓力超負(fù)荷所致大鼠心肌中Nox2和Nox4 的mRNA及蛋白表達(dá)的升高(P<0.05 或P<0.01),見(jiàn)圖2、3。這一結(jié)果表明，EPO可抑制心肌Nox2和Nox4的表達(dá)。

6 心室肌CD45、F4/80和TGF-β表達(dá)的變化

研究證實(shí)，眾多炎癥因子在MF的進(jìn)展過(guò)程中起重要作用。我們采用Western blotting法觀(guān)察壓力超負(fù)荷大鼠心肌炎癥因子表達(dá)的變化以及EPO對(duì)其的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。壓力超負(fù)荷導(dǎo)致大鼠心肌中白細(xì)胞分化抗原CD45、巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物F4/80和細(xì)胞因子TGF-β表達(dá)增多(P<0.05 或P<0.01)，提示心肌中有血液源性的炎癥細(xì)胞，包括T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的浸潤(rùn)。而EPO抑制了上述指標(biāo)的升高(P<0.05 或P<0.01)。表明EPO可抑制心肌內(nèi)炎性反應(yīng)的發(fā)生。

Figure 1. Abdominal aortic constriction induced cardiac fibrosis and EPO reversed this change (Masson’s staining, ×400). Mean±SD. n=12. ##P<0.01 vs sham; ** P<0.01 vs model.

Figure 2. Effects of EPO on mRNA expression of Nox2 and Nox4 in rat left ventricular myocardium. Mean±SD. n=6. #P<0.05, ## P<0.01 vs sham; *P<0.05, ** P<0.01 vs model.

Figure 3. Effects of EPO on protein expression of Nox2 and Nox4 in rat left ventricular myocardium. Mean±SD. n=6. ## P<0.01 vs sham; *P<0.05 vs model.

Figure 4. Effects of EPO on protein expression of CD45，F(xiàn)4/80 and TGF-β in rat left ventricular myocardium. Mean±SD. n=3. #P<0.05, ## P<0.01 vs sham;*P<0.05, ** P<0.01 vs model.

討 論

研究顯示，ROS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡及由機(jī)械拉伸或神經(jīng)激素性刺激誘發(fā)的心肌肥厚性反應(yīng)，并由此引發(fā)心血管疾病。NADPH氧化酶是細(xì)胞內(nèi)一組具有氧化活性的蛋白，是心肌ROS的主要來(lái)源，包括Nox1、Nox2(gp91phox)、Nox3、Nox4、Nox5、Duox1和Duox2，也稱(chēng)為Nox蛋白家族。研究表明，Nox2和Nox4大量表達(dá)于心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。與正常鼠相比，Nox2基因敲除小鼠基礎(chǔ)血壓降低，并可完全阻止血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管過(guò)度增生同時(shí)清除過(guò)多的氧化劑。C57/BL小鼠心梗后，梗死心肌Nox2表達(dá)明顯增強(qiáng)，梗死部位有大量巨噬細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞堆積，并有炎癥因子及膠原的沉積；而敲除Nox2基因后，這些改變明顯減輕[8]。也有研究證實(shí)，Nox4在壓力超負(fù)荷小鼠的心肌肥大、間質(zhì)纖維化和心肌細(xì)胞凋亡及心臟的老齡化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9-11]。本研究結(jié)果顯示，壓力超負(fù)荷導(dǎo)致大鼠心肌Nox2和Nox4表達(dá)明顯增多，與以上證據(jù)相符合，說(shuō)明Nox2和Nox4在心肌重構(gòu)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

EPO是由腎臟分泌的一種多效性細(xì)胞因子，主要作用于骨髓造血細(xì)胞，與其特異性受體結(jié)合，促進(jìn)紅系祖細(xì)胞的存活、增殖和分化，并可抑制其凋亡。近年來(lái)的大量研究顯示，EPO還具有廣泛的非造血作用[12]。在心臟，研究顯示，EPO通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶2/金屬蛋白酶組織抑制因子2之間的平衡進(jìn)而在抗腫瘤藥物導(dǎo)致的心臟中毒過(guò)程中發(fā)揮保護(hù)作用[13]。EPO還可促進(jìn)高膽固醇所致心肌梗塞大鼠心肌的復(fù)原[14]。EPO和依那普利聯(lián)合應(yīng)用可抑制心肌纖維化和微血管的損傷[15]。在缺血性心臟病，EPO可抑制心肌細(xì)胞的凋亡，同時(shí)具有抗炎、抗氧化及改善心功能的作用[16]。我們的研究結(jié)果顯示，壓力超負(fù)荷導(dǎo)致大鼠血壓升高、心肌肥大并出現(xiàn)纖維化癥狀，在給予EPO干預(yù)治療后，這些變化均減輕，提示EPO有抵抗壓力超負(fù)荷導(dǎo)致的心肌纖維化的作用。

研究顯示，EPO可上調(diào)超氧化物歧化酶等抗氧化酶的表達(dá)，使其活性增強(qiáng)，進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激產(chǎn)物的生成；另外，EPO與其受體結(jié)合后可抑制線(xiàn)粒體氧自由基的產(chǎn)生，從而減輕血管損傷。本研究中，我們檢測(cè)了模型組大鼠心肌Nox2和Nox4mRNA及蛋白水平的表達(dá)，結(jié)果顯示，壓力超負(fù)荷導(dǎo)致大鼠心肌Nox2和Nox4表達(dá)增強(qiáng)；而使用EPO干預(yù)治療后，Nox2和Nox4mRNA及蛋白水平的表達(dá)均下降，這一結(jié)果表明，EPO可抑制壓力超負(fù)荷所致的大鼠心肌Nox2和Nox4表達(dá)，進(jìn)而抑制心肌氧化應(yīng)激反應(yīng)。我們同時(shí)檢測(cè)了各組大鼠心肌炎癥相關(guān)因子表達(dá)的變化，結(jié)果顯示，壓力超負(fù)荷導(dǎo)致大鼠心肌中白細(xì)胞分化抗原CD45、巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物F4/80和細(xì)胞因子TGF-β表達(dá)增加，提示炎癥細(xì)胞在心肌中的浸潤(rùn)，而EPO抑制了這種浸潤(rùn)，表明EPO可抑制心肌內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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