李 新， 姜 黎， 楊 杪， 吳玉文， 孫蘇欣， 孫家忠

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院1內(nèi)分泌科, 2綜合科, 湖北 武漢 430071)

現(xiàn)有研究表明，脂肪組織已經(jīng)不僅僅是胰島素作用的靶器官與能量儲備組織，而是具有多種生物學(xué)功能的內(nèi)分泌器官。脂肪細(xì)胞或脂肪組織分泌的活性分子被稱為脂肪因子，參與體內(nèi)糖脂代謝、炎癥反應(yīng)、動脈粥樣硬化、胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及胰島β細(xì)胞功能調(diào)控等多個病理生理過程，成為聯(lián)系肥胖與2型糖尿病的重要因素。胰島素抵抗是一個慢性亞臨床炎癥過程，腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-6 等多種炎癥因子可以降低機(jī)體對胰島素的敏感性[1]。

C1q/TNF相關(guān)蛋白3(C1q/TNF-relatedprotein3,CTRP3)是新近發(fā)現(xiàn)的一種脂肪因子，與脂聯(lián)素同屬C1q/TNF超家族，具有降糖、抗炎、抑制肝糖異生、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖與遷移等效應(yīng)[2-5]。但是CTRP3對脂肪組織胰島素敏感性的效應(yīng)目前并不清楚。因此，本研究通過體外培養(yǎng)3T3-L1脂肪細(xì)胞，以軟脂酸(palmicacid,PA)誘導(dǎo)胰島素抵抗的3T3-LI脂肪細(xì)胞模型，觀察CTRP3對胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率、TNF-α及IL-6表達(dá)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4(glucosetransporter4,GLUT-4) 表達(dá)等的效應(yīng)，探討CTRP3對脂肪細(xì)胞胰島素敏感性的調(diào)節(jié)效應(yīng)及可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞與試劑

小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞(來源于美國菌種保藏中心，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清、牛血清白蛋白、0.25%胰蛋白酶、青/鏈霉素、異丁基-甲基-黃嘌呤(IBMX)和油紅O(Sigma)；地塞米松(dexmethasone,DEX)、KRP緩沖液(131.2mmol/L NaCl、4.71 mmol/L KCl、2.47 mmol/L CaCl2、2.48 mmol/L Na3PO4、1.24 mmol/L MgSO4，10 mmol/L HEPES，pH 7.4)、2-脫氧-[3H]-葡萄糖(武漢楷倫化學(xué)新材料有限公司)；重組人胰島素(諾和公司)；重組CTRP3蛋白(BioVendor)；小鼠TNF-α及IL-6 ELISA檢測試劑盒(武漢中幟生物科技有限公司)；葡萄糖試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司)；Trizol(Promega)；熒光定量PCR試劑盒(Invitrogen)；兔抗小鼠GLUT-4及β-actin抗體(Santa Cruz)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(北京中山公司)；ECL試劑盒(Pierce)。

2 細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

將3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，在37 ℃、5%CO2的條件下，以含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞融合48 h后，加入含有IBMX(0.5 mmol/L)、DEX(0.25 mmol/L)及人胰島素(1 μmol/L)的培養(yǎng)液，48 h后換為含胰島素(1 μmol/L)的培養(yǎng)液再培養(yǎng)48 h，隨后以含有10%的胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h換液1次，誘導(dǎo)分化8～12 d后90%以上3T3-L1細(xì)胞呈脂肪細(xì)胞表型時可用于實(shí)驗(yàn)。

3 構(gòu)建 3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型, 鑒定, 干預(yù)與分組

將誘導(dǎo)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞，以含有0.2%無游離脂肪酸的BSA的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜，再換為含有胰島素(0.1 μmol/L)、1%無游離脂肪酸的BSA以及PA(1.0 mmol/L)的DMEM培養(yǎng)24 h，構(gòu)建胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細(xì)胞模型。通過比較葡萄糖消耗量及葡萄糖攝取率來反映PA誘導(dǎo)后3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗情況。

將上述細(xì)胞分為正常對照(normal control,NC)組、胰島素抵抗(insulin resistance,IR)組及CTRP3干預(yù)(CTRP3 intervention,CI)組，CI組又分不同濃度(10、50、250、1 250 μg/L)重組CTRP3蛋白干預(yù)12 h及250 μg/L CTRP3干預(yù)不同時間(2、6、12、24 h)等亞組。分別以含有不同濃度重組CTRP3蛋白的DMEM高糖(25.0 mmol/L)培養(yǎng)液培養(yǎng)不同時間，用于進(jìn)一步檢測。

4 主要方法

4.1葡萄糖消耗量 收集上述培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)液，用葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖濃度，計(jì)算其消耗量，公式為：干預(yù)前培養(yǎng)液中高糖濃度(25.0 mmol/L)-干預(yù)后各組葡萄糖濃度;每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取其平均值。

4.2炎癥因子分泌的檢測 取上述細(xì)胞培養(yǎng)液，以酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測上清中的TNF-α及IL-6含量，按照說明書進(jìn)行操作。

4.3葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn) 將上述細(xì)胞以KRP緩沖液洗3次，再以含有胰島素(10 nmol/L)的KRP緩沖液孵育30 min，加入含2-脫氧-[3H]-葡萄糖(1.85×104Bq/mL)的KRP緩沖液孵育10 min，然后以預(yù)冷的含10 mmol/L葡萄糖的PBS液快速洗滌3次終止反應(yīng)，再加入1 mL NaOH(0.1 mmol/L)，2 h后取0.2 mL細(xì)胞裂解液于閃爍液中避光放置12 h，用液體閃爍計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。另設(shè)一組細(xì)胞加入細(xì)胞松弛素B(10 μmol/L)作為對照，所有數(shù)據(jù)減去該值，作為各組葡萄糖攝取率。

4.4實(shí)時熒光定量PCR檢測炎癥因子及GLUT-4mRNA的表達(dá)Trizol法提取總RNA，RT-PCR擴(kuò)增目的基因。PCR引物由上海賽百盛公司合成，序列如下：IL-6正義鏈5’-AGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3’，反義鏈5’-CAGAATTGCCATTGCACAAC-3’;TNF-α正義鏈 5’-ACGGCATGGATCTCAAAGAC-3’，反義鏈5’-CGGCAGAGACCACCTTGAACT-3’；GLUT-4：正義鏈 5’-CCCCGCTGGAATGAGGTTTTTGAGGTGAT-3’，反義鏈5’-CAGACAGGGGCCGAAGATTGGGAGACAGT-3’;β-actin正義鏈 5’-ACACCCGCCACCAGTTCGC-3’，反義鏈5’-TCTCCCCCTCATCACCCACAT-3’。反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性95 ℃ 15s；三步法PCR：95 ℃ 15s, 58 ℃ 10s，擴(kuò)增45個循環(huán)；72 ℃ 45s。

4.5Western blotting檢測GLUT-4蛋白的表達(dá) 提取總蛋白，取15 μL樣品經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將轉(zhuǎn)印后的PVDF膜用兔抗小鼠GLUT-4抗體(1∶1 000)和抗β-actin抗體(1∶1 000)孵育，4℃搖床上過夜；然后以0.2%吐溫/PBS洗滌膜3次，每次10 min；再以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(Ⅱ抗)孵育膜，37 ℃搖床振蕩1 h，用0.2%吐溫/PBS洗滌膜3次，每次10 min；然后將膜浸于ECL中，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸，1 min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好放入X光片夾中，在暗室中曝光、顯影和定影。對膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的灰度值，以GLUT-4條帶與β-actin條帶的灰度比值表示其蛋白相對表達(dá)量。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±SD) 表示，采用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行分析, 組間差異采用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CTRP3 對3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響

與NC組相比，IR組葡萄糖消耗量顯著下降[(17.3±1.2) mmol/Lvs(8.6±0.7)mmol/L，P<0.01]，提示其存在明顯胰島素抵抗；與IR組相比，CI組隨干預(yù)濃度增加(10、50、250、1 250 μg/L)，葡萄糖消耗量分別增加22.1%、42.9%、76.6%及80.5%(均P<0.01)；10、50及250 μg/L干預(yù)組之間相比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，1 250 μg/L與250 μg/L干預(yù)組之間相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1重組CTRP3蛋白對胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響

Table 1. The impact of recombinant CTRP3 protein on the glucose consumption of insulin resistant 3T3-L1 adipocytes (Mean±SD.n=9)

GroupCTRP3 content ( μg/L)Palmic acid(mmol/L)Insulin(μmol/L)Glucose consumption(mmol/L) NC000.117.30±1.91 IR01.00.18.56±0.73??CI 1101.00.110.44±0.88??#CI 2501.00.112.22±1.30??##CI 32501.00.115.12±1.83??##CI 41 2501.00.115.45±1.81?##

NC:normalcontrol;IR:insulinresistance;CI:CTRP3intervention.*P<0.05,**P<0.01 vsNCgroup;#P<0.05,##P<0.01 vsIRgroup.

2 CTRP3對3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率的影響

2.1CTRP3對3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率的劑量-效應(yīng)關(guān)系 將IR組葡萄糖攝取率設(shè)為1，較NC組下降了57.9%(P<0.01);與IR組相比，CI組不同濃度CTRP3(10、50、250、1 250 μg/L)干預(yù)12 h使胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率分別增加39.0%、68.0%、108.0%及111.0%(均P<0.01)。10、50及250 μg/L CTRP3干預(yù)組之間相比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，1 250 μg/L與250 μg/L干預(yù)組之間相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示干預(yù)時間為12 h的條件下，250 μg/L CTRP3對脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率的作用接近最大化，見表2。

2.2CTRP3對3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率的時間-效應(yīng)關(guān)系 以250μg/LCTRP3處理胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細(xì)胞，進(jìn)一步觀察其時間-效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果顯示，CTRP3干預(yù)2、6、12、24h葡萄糖攝取率分別增加了23.0%、79.0%、109.0%及114.0%(均P<0.01)；CTRP3干預(yù)2、6、12h葡萄糖攝取率均較前一時點(diǎn)明顯增加(均P<0.01)，干預(yù)24h與12h相比，葡萄糖攝取率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示干預(yù)濃度為250μg/L的條件下，CTRP3干預(yù)12h對脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率的效應(yīng)接近最大化，見表3。

表2 重組CTRP3蛋白對胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率的劑量-效應(yīng)關(guān)系

**P<0.01vsCTRP3 content 0 μg/L group.

表3 重組CTRP3蛋白對胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率的時間-效應(yīng)關(guān)系

**P<0.01vsCTRP3 content 0 h group.

3 CTRP3對胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響

與NC組相比，IR組上清中TNF-α及IL-6濃度分別增加了58.6%及51.8%(均P<0.01)，其mRNA相對表達(dá)量分別增加了92.0%及62.0%(均P<0.01)； 250 μg/L的CTRP3干預(yù)12 h，其上清中的TNF-α及IL-6濃度較IR組分別降低17.4%及17.1%(均P<0.01)，其mRNA表達(dá)分別較對照組降低26.0%及18.9%(均P<0.01)，見圖1、2。

Figure 1. The impact of CTRP3 on the release of TNF-α and IL-6 in the insulin resistant 3T3-L1 adipocytes with different treatments.Mean±SD.n=9.**P<0.01 vs NC group；## P<0.01 vs IR group.

Figure 2. The relative mRNA expression of TNF-α, IL-6 and GLUT-4 in the 3T3-L1 adipocytes with different treatments.Mean±SD.n=9.** P<0.01 vs NC group; ##P<0.01 vs IR group.

4 CTRP3對胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細(xì)胞GLUT-4 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

與NC組相比，IR組GLUT-4 mRNA及蛋白相對表達(dá)量分別降低了48.0%及46.0%(均P<0.01)；250 μg/L CTRP3干預(yù)12 h，其GLUT-4 mRNA及蛋白表達(dá)水平較IR組分別增加61.5%及55.6%(均P<0.01)，這可能是CTRP3干預(yù)導(dǎo)致葡萄糖攝取率增加的直接原因，見圖2、3。

討 論

脂肪組織及脂肪因子與胰島素抵抗及2型糖尿病關(guān)系密切，脂肪組織既是胰島素作用的重要靶器官，又通過分泌多種脂肪因子、細(xì)胞因子、炎癥因子等調(diào)節(jié)胰島素敏感性，成為連接肥胖與2型糖尿病的重要因素。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素、內(nèi)臟脂肪素等多種脂肪因子，并且還不斷有新的脂肪因子被報道。脂聯(lián)素是目前研究最為廣泛的脂肪因子之一，具有增加胰島素敏感性、抗炎、抗動脈粥樣硬化等作用，其血漿濃度與胰島素抵抗及2型糖尿病密切相關(guān)。但令人意外的是敲除脂聯(lián)素基因的動物模型僅僅表現(xiàn)出輕度代謝異常，提示體內(nèi)可能還存在其它與脂聯(lián)素功能重疊的代謝調(diào)節(jié)因子[6]。正是在探索上述因子的研究中發(fā)現(xiàn)了C1q/TNF-相關(guān)蛋白1-15(CTRP1-15)，其中與糖脂代謝關(guān)系較為密切的是CTRP3。相關(guān)研究表明CTRP3具有改善整體血糖代謝的作用，其機(jī)制可能與抑制肝糖輸出有關(guān)，但是CTRP3對胰島素抵抗的作用并不清楚。因此，本研究通過構(gòu)建脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型，給予重組CTRP3蛋白干預(yù)，觀察其對脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率的效應(yīng)，并初步探討炎癥在其中的作用。

Figure 3. The relative protein expression of GLUT-4 in the insulin resistant 3T3-L1 adipocytes with different treatments.Mean±SD.n=9. ** P<0.01 vs NC group; ##P<0.01 vs IR group.

本研究通過軟脂酸構(gòu)建胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細(xì)胞模型，結(jié)果顯示軟脂酸培養(yǎng)后3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率及葡萄糖消耗量較對照組均顯著降低，提示軟脂酸培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞存在明顯胰島素抵抗。以不同濃度(10、50、250、1 250 μg/L)重組CRTP3蛋白干預(yù)12 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨CTRP3濃度增加，脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗量及葡萄糖攝取率均顯著增加，250 μg/L可能為其最佳作用濃度。進(jìn)一步對CTRP3作用的時間-效應(yīng)關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，隨CTRP3作用時間(2、6、12、24 h)的增加，脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗量及葡萄糖攝取率均明顯增加，12 h時其作用已趨于最大。這些結(jié)果提示脂肪因子CTRP3在一定范圍內(nèi)具有時間、劑量依賴性地促進(jìn)脂肪細(xì)胞利用葡萄糖，改善其胰島素敏感性的效應(yīng)。

為進(jìn)一步探討CTRP3改善胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞胰島素敏感性的機(jī)制，本研究觀察了250 μg/L重組CTRP3蛋白對脂肪細(xì)胞炎癥因子TNF-α與IL-6 mRNA表達(dá)及分泌量的影響。結(jié)果顯示CTRP3可以顯著降低TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平及蛋白分泌量，提示CTRP3可能通過下調(diào)脂肪細(xì)胞炎癥因子表達(dá)改善其胰島素敏感性。Kopp等[3]的研究表明CTRP3可以抑制脂多糖(LPS)、游離脂肪酸(十二烷酸)以及Toll樣受體配體等誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞及單核細(xì)胞炎癥因子表達(dá)，與本研究結(jié)果類似；而下調(diào)CTRP3的表達(dá)則導(dǎo)致脂肪細(xì)胞單核細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá)增多、脂聯(lián)素水平下降，以及脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴體積及甘油三酯含量減少，即誘導(dǎo)成熟脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化為非成熟細(xì)胞，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，提示CTRP3在調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞炎癥反應(yīng)中具有重要作用，但該研究并未觀察CTRP3對脂肪細(xì)胞胰島素敏感性的效應(yīng)。

炎癥因子可能通過多種機(jī)制損害胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致胰島素抵抗。炎癥信號通路主要包括IκK/ NF-κB(核因子κB抑制物激酶/核因子κB)途徑 、JNK(c-Jun氨基末端激酶)途徑、SOCS(細(xì)胞因子信號抑制物)-3通路等。IκK是NF-κB炎癥信號通路的關(guān)鍵成分，同時又是胰島素受體和IRS(胰島素受體底物) 的絲氨酸磷酸化激酶，可以催化IRS 307 位的絲氨酸磷酸化，導(dǎo)致正常的酪氨酸磷酸化減少，抑制胰島素受體與IRS 的結(jié)合，損害胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]；JNK 屬于促分裂原活化蛋白激酶中的一個途徑, 也可通過磷酸化IRS 307 位的絲氨酸,損害胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]；SOCS-3是細(xì)胞因子激活途徑的負(fù)反饋調(diào)節(jié)物，通過競爭性抑制IRS酪氨酸磷酸化，減少IRS與磷脂酰肌醇3-激酶的調(diào)節(jié)亞單位p85 的結(jié)合，以及通過泛素介導(dǎo)的IRS降解等機(jī)制損害胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]，最終引起葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子(glucose transporter,GLUT)表達(dá)下調(diào)，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)減少，導(dǎo)致葡萄糖利用率下降，出現(xiàn)胰島素抵抗。本研究發(fā)現(xiàn)，CTRP3干預(yù)后，隨炎癥因子表達(dá)水平下降，脂肪細(xì)胞GLUT-4基因及蛋白表達(dá)水平均增加，這可能是脂肪細(xì)胞葡萄糖利用率增加的直接原因，也進(jìn)一步提示CTRP3具有改善3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素敏感性的作用。

總之，本研究表明新的脂肪因子CTRP3具有改善脂肪組織胰島素敏感性的效應(yīng)，其機(jī)制可能與下調(diào)脂肪細(xì)胞炎癥因子表達(dá)，改善胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子表達(dá)等有關(guān)，提示CTRP3可能是胰島素抵抗及2型糖尿病防治研究的新的分子靶點(diǎn)。但是，CTRP3下調(diào)脂肪細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的信號機(jī)制以及CTRP3對脂肪細(xì)胞胰島素信號通路的直接效應(yīng)本研究并未涉及，尚需要進(jìn)一步研究。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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