田 欣，王 晶，趙芯晨，周小超，閆 峰，何婧瑜，郭德玉

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京 100053)

心跳呼吸驟停是臨床常見的急危重癥。據(jù)美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)及卒中委員會(huì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，美國(guó)2008 年有院外心跳驟停166,200名患者，40,000名患者心肺復(fù)蘇(cardiopulmonary resuscition，CPR)成功后進(jìn)入ICU 接受進(jìn)一步治療，超過50%的患者遺留嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙[1]。我國(guó)僅據(jù)2008 年阜外醫(yī)院國(guó)家“十一五”課題結(jié)果顯示：中國(guó)每年約54.4萬(wàn)人因心源性“猝死"需進(jìn)行CPR[2]。心臟驟停 (cardiac Arrest，CA)和心肺復(fù)蘇是復(fù)雜的病理生理變化過程。許多發(fā)病機(jī)制尚不清楚．由于臨床研究受多方面因素的干擾，深入研究CPR的病理生理機(jī)制受到一定限制。動(dòng)物模型是較為理想的載體模型，能夠?qū)Ω鞣N混雜因素進(jìn)行嚴(yán)格控制，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可重復(fù)性。因此建立一個(gè)良好的動(dòng)物模型，可為人類疾病發(fā)病機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。作為如何減輕CPR 后患者神經(jīng)功能障礙，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)的基礎(chǔ)研究：制備一種穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型，在當(dāng)前是應(yīng)該首要解決的。

1 材料和方法

1.1 藥品試劑與儀器

0.1%鹽酸腎上腺素注射液 (天津金縷氨基酸有限公司，批號(hào)：0508201),0.9%生理鹽水注射液(天津百特醫(yī)療用品有限公司),肝素鈉注射液(江蘇常州升華千紅制藥有限公司),恩弗烷(河北九派制藥有限公司 Enflurane)。

電生理刺激器(日本光電，SEN-3301)，食道電極(江蘇電子儀器廠)，小動(dòng)物麻醉罐(美國(guó)NatureGene Corp，tech3)，小動(dòng)物呼吸機(jī)(美國(guó)Harvard，MA1 55-7058)，多導(dǎo)生理記錄儀(美國(guó)BIOPAC，MP150)，電子天平(美國(guó)OHAUS)，顯微鏡(Olympus，DP70)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF 級(jí)SD雄性大鼠，2月齡16只，4月齡16只,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供【SCXK(京)2012-0001】，飼養(yǎng)在宣武醫(yī)院動(dòng)物房【SYXK(京)2010-0013】。動(dòng)物隨機(jī)分組：(1)4月齡假手術(shù)組(OC組，n=8)；2月齡假手術(shù)組(YC，n=8)(2)4月齡心肺復(fù)蘇模型組(OM組，n=8)；2月齡心肺復(fù)蘇模型組(YM組，n=8))。

1.3 經(jīng)食管心臟起搏誘發(fā)室顫

大鼠術(shù)前不禁食，顯微鏡下經(jīng)口氣管插管，插入16 g套管接小動(dòng)物呼吸機(jī)，持續(xù)以1%～2%恩弗烷聯(lián)合30%氧氣、70%N2O混合吸入全麻。分離左側(cè)股動(dòng)靜脈：經(jīng)股動(dòng)脈插入PE50管接MP150生理記錄儀血壓測(cè)量系統(tǒng)，監(jiān)測(cè)動(dòng)物血壓改變；經(jīng)股靜脈插管，開放靜脈給藥通道；經(jīng)四肢皮下針記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)動(dòng)物心電圖改變；經(jīng)肛門監(jiān)測(cè)肛溫，維持體溫37℃±0.5℃。

4極5F起搏電極經(jīng)口插入食管約7 cm ,電極近端與刺激輸出端相連。測(cè)定心室起搏閾值,誘發(fā)室顫電壓應(yīng)高于起搏閾值6～8V(28～36V)，頻率20～30 Hz，脈寬10 ms。超速起搏，直至大鼠室顫、心跳停搏、逸搏等持續(xù)存在，血壓小于25 mmHg，正常的脈搏波形消失，提示誘導(dǎo)室顫成功，停止起搏。6 min后進(jìn)行CPR：經(jīng)股靜脈注射腎上腺素40 μg/ kg；打開小動(dòng)物呼吸機(jī)，根據(jù)大鼠體重由呼吸機(jī)自動(dòng)設(shè)定通氣頻率,潮氣量為6 mL/kg；人工手法行胸外心臟按壓,頻率200次/min，按壓深度為大鼠胸廓前后徑1/ 3。持續(xù) 3 min，未復(fù)蘇大鼠進(jìn)行5J非同步電除顫；總復(fù)蘇時(shí)間超過15 min剔除。大鼠恢復(fù)室上性心率，收縮壓超過60 mmHg并持續(xù)10 min以上，認(rèn)為復(fù)蘇成功。實(shí)驗(yàn)全程監(jiān)測(cè)心電和血壓，超出規(guī)定范圍者剔除。

1.4 室顫過程中生理指標(biāo)的監(jiān)測(cè)

不同月齡的SD大鼠電刺激過程中血壓的監(jiān)測(cè)比較。不同月齡SD大鼠致CA過程中持續(xù)電刺激時(shí)間、CPR時(shí)間與血壓變化的統(tǒng)計(jì)。

1.5 各組大鼠不同時(shí)間段神經(jīng)功能缺失評(píng)分(neurologic deficit scores，NDS)

按照心肺復(fù)蘇后國(guó)際通用的80分NDS評(píng)分[3-4]細(xì)則，復(fù)蘇前3 d評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能，剔出NDS最好或最差的大鼠；ROSC后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d，由受專業(yè)訓(xùn)練的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)員對(duì)各組SD大鼠采用雙盲法進(jìn)行獨(dú)立評(píng)分，最終NDS評(píng)分取兩者平均值。

1.6 各組大鼠不同時(shí)間段復(fù)蘇組神經(jīng)功能亞組評(píng)分：

選取平衡木實(shí)驗(yàn)，網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)，懸崖回避實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估動(dòng)物運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力，選取疼痛刺激實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)感覺功能。復(fù)蘇前3 d評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能，剔出NDS最好或最差的大鼠；ROSC 后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d，由受專業(yè)訓(xùn)練的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)員對(duì)各組SD大鼠采用雙盲法進(jìn)行獨(dú)立評(píng)分，最終NDS評(píng)分取兩者平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 不同月齡的SD大鼠電刺激過程中血壓的監(jiān)測(cè)比較

經(jīng)食道電刺激致CA過程中，2月齡大鼠血壓維持在80～90 mmHg不變，直到CA出現(xiàn)血壓驟降至25 mmHg(圖1)；而4月齡大鼠血壓從電刺激初期到CA出現(xiàn)一直維持在40～50 mmHg，CA出現(xiàn)時(shí)血壓驟降至20 mmHg以下，甚至直線。(圖2)。

2.2 不同月齡SD大鼠的成模率及死亡率統(tǒng)計(jì)：

4月齡組8只大鼠，成模7只，成模率87.5%，死亡1只，死亡率12.5%，；2月齡組大鼠成模5只，成模率62.5%，死亡1只，死亡率12.5%。

2.3 不同月齡SD大鼠誘發(fā)CA過程中持續(xù)電刺激時(shí)間、CPR時(shí)間與血壓變化的統(tǒng)計(jì)(表1)

在電刺激誘發(fā)CA過程中，4月齡組大鼠與2月齡組大鼠電刺激前血壓無(wú)顯著差異的情況下，誘發(fā)CA的總時(shí)間，以及發(fā)生CA進(jìn)行復(fù)蘇搶救的時(shí)間無(wú)顯著差異；而在此過程中造成的血壓變化，有極顯著性差異(P< 0.01)。

2.4 各組大鼠復(fù)蘇后 6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d神經(jīng)功能評(píng)分NDS(neurologic deficit scores)的情況：(表2)

在NDS總評(píng)分中，兩個(gè)月齡的模型組與對(duì)照組之間比較6 h、12 h、24 h、48 h、72 h評(píng)分均有顯著性差異(P< 0.05)，7 d無(wú)顯著性差異。

在NDS總評(píng)分中，OC組(4月齡假手術(shù)組)與YC組(2月齡假手術(shù)組)之間相比較，6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評(píng)分均無(wú)顯著性差異；OM組(4月齡心肺復(fù)蘇模型組)與YM組(2月齡心肺復(fù)蘇模型組)之間相比較6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評(píng)分均無(wú)顯著性差異。

2.5 各組大鼠復(fù)蘇后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d NDS亞組評(píng)分結(jié)果分析：

2.5.1 各組大鼠復(fù)蘇后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)評(píng)分結(jié)果(表3)：

在網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)中，兩個(gè)月齡的模型組與對(duì)照組之間比較6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評(píng)分均有顯著性差異(P< 0.05)；不同月齡的對(duì)照組之間比較6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評(píng)分均無(wú)顯著性差異；不同月齡的模型組之間比較6 h、12 h、24 h、48 h評(píng)分有顯著性差異(P< 0.05)，72 h、7 d評(píng)分無(wú)顯著性差異。

表1 2月齡心肺復(fù)蘇模型組(YM組)與4月齡心肺復(fù)蘇模型組(OM組)大鼠電刺激與血壓變化

圖1 YM組大鼠電刺激過程中血壓變化不明顯

圖2 OM組大鼠電刺激過程中血壓維持低灌注狀態(tài)

表2不同月齡組大鼠各時(shí)間點(diǎn)NDS評(píng)分結(jié)果

Tab.2The NDS score of rats at different ages group

注：神經(jīng)功能評(píng)分，OM組與OC組相比：*P < 0.05，**P < 0.01；YM組與YC組相比：◆P < 0.05，◆◆P < 0.01。

表3 不同月齡組大鼠各時(shí)間點(diǎn)網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)評(píng)分結(jié)果

2.5.2 各組大鼠大鼠復(fù)蘇后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d平衡木實(shí)驗(yàn)評(píng)分結(jié)果(表4)：在平衡木實(shí)驗(yàn)中，不同月齡的模型組與對(duì)照組6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評(píng)分均有顯著性差異(P< 0.05)；不同月齡的對(duì)照組6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評(píng)分均無(wú)顯著性差異；不同月齡的模型組6 h、12 h、24 h評(píng)分有顯著性差異(P< 0.05)，48 h、72 h、7 d評(píng)分無(wú)顯著性差異。

表4 不同月齡組大鼠各時(shí)間點(diǎn)平衡木實(shí)驗(yàn)評(píng)分結(jié)果

2.5.3 各組大鼠大鼠復(fù)蘇后6 h、12 h、24 h、48h、72 h、7 d懸崖回避實(shí)驗(yàn)評(píng)分結(jié)果(見表-5)：在懸崖回避實(shí)驗(yàn)中，2月齡組大鼠模型組與對(duì)照組6 h評(píng)分有顯著性差異(P< 0.05)，而12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評(píng)分無(wú)顯著性差異；4月齡組大鼠模型組與對(duì)照組6 h、12 h、24 h、48h、72 h、7 d評(píng)分無(wú)顯著性差異。不同月齡的對(duì)照組6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評(píng)分均無(wú)顯著性差異；不同月齡的模型組6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評(píng)分無(wú)顯著性差異。

表5 不同月齡組大鼠各時(shí)間點(diǎn)懸崖回避實(shí)驗(yàn)評(píng)分結(jié)果

表6 不同月齡組大鼠各時(shí)間點(diǎn)疼痛刺激實(shí)驗(yàn)評(píng)分結(jié)果

2.5.4 各組大鼠大鼠復(fù)蘇后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d疼痛刺激實(shí)驗(yàn)評(píng)分結(jié)果(表6)：在疼痛刺激實(shí)驗(yàn)中，2月齡組大鼠模型組與對(duì)照組6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d均有顯著性差異(P< 0.05)，4月齡組大鼠模型組與對(duì)照組12 h、24 h、48 h、72 h有顯著性差異(P< 0.05),7 d評(píng)分無(wú)顯著性差異。

不同月齡的對(duì)照組6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d評(píng)分均無(wú)顯著性差異；不同月齡的模型組6 h、12 h有顯著性差異(P< 0.05)，而24 h、48 h、72 h、7 d評(píng)分無(wú)顯著性差異。

3 討論

目前，心肺復(fù)蘇領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)研究大多基于兩種方法的動(dòng)物模型：窒息法與電刺激誘發(fā)竄顫法致心搏驟停。國(guó)內(nèi)的研究較多采用窒息法模型[5-6]，而國(guó)外的研究多采用室顫法動(dòng)物模型[7]。心肺復(fù)蘇動(dòng)物模型的制作方法有難有易，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)室具備的條件(設(shè)備、技術(shù)力量)、實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)等綜合分析，選擇最適宜的動(dòng)物模型。自Utstein-Style指南頒布以來(lái)，心臟驟停動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究及文獻(xiàn)報(bào)道已逐步規(guī)范與統(tǒng)一通過Utstein-Style指南對(duì)各心臟驟停動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究的總體引導(dǎo)，統(tǒng)一化、標(biāo)準(zhǔn)化各種動(dòng)物模型的制作方法和評(píng)估參數(shù)，反復(fù)驗(yàn)證各種方法的可行性和可重復(fù)性，實(shí)驗(yàn)研究者們可以選擇到一種與各自研究的疾病有最為相似的病理生理學(xué)改變和血流動(dòng)力學(xué)變化，與臨床病例有良好相關(guān)性的最佳動(dòng)物模型。

CPR后，腦損傷的病理生理過程其實(shí)質(zhì)是腦缺血缺氧再灌注損傷的過程，病理機(jī)制涉及到：微循環(huán)障礙、自由基損傷、興奮性氨基酸中毒、鈣超載及神經(jīng)元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常等各種因素相互促進(jìn)，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，引起神經(jīng)功能障礙[8]。

當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型多利用血管夾閉或窒息等方法制備全腦缺血再灌注模型研究神經(jīng)損傷的機(jī)制，與心源性心跳驟停相比它們?cè)诓±砩磉^程上存在較大差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)論不能完全共用[9-10]；在研究?jī)?nèi)容方面，大多數(shù)研究?jī)H限于對(duì)神經(jīng)元存活、代謝、功能等某一方面的作用，對(duì)CPR 后神經(jīng)保護(hù)方面的綜合評(píng)價(jià)，研究極少。

理想的動(dòng)物模型將盡可能反映出臨床病理生理變化過程，這對(duì)于心肺復(fù)蘇研究質(zhì)量有重要意義。本研究應(yīng)用交流電生理刺激儀經(jīng)食道調(diào)搏誘發(fā)大鼠心搏驟停模型，意在尋找更簡(jiǎn)單、更接近臨床實(shí)際的研究模型。

本實(shí)驗(yàn)選用經(jīng)食道起搏誘發(fā)室顫制備大鼠心肺復(fù)蘇模型，擬對(duì)比分析2月齡與4月齡大鼠型在復(fù)蘇過程中各項(xiàng)監(jiān)測(cè)指標(biāo)的變化，并分析監(jiān)測(cè)指標(biāo)；以及CPR 后各時(shí)間點(diǎn)NDS 及亞組評(píng)分的情況，試圖綜合評(píng)價(jià)不同月齡大鼠制備心肺復(fù)蘇模型的可行性與，為臨床治療提供穩(wěn)定有效的模型平臺(tái)。旨在找到更適合制備心肺復(fù)蘇大鼠模型的動(dòng)物條件，尋求一種穩(wěn)定性高實(shí)用性強(qiáng)的心肺復(fù)蘇大鼠模型，為動(dòng)物模型建立的標(biāo)準(zhǔn)化及進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)利用4～6 min室顫法制備大鼠心肺復(fù)蘇模型，在熟練掌握心肺復(fù)蘇模型制作方法的基礎(chǔ)上，考慮月齡較低的年輕大鼠心臟停跳后自身轉(zhuǎn)復(fù)率極高，且立即恢復(fù)心跳、血壓的特點(diǎn)，選用了常規(guī)實(shí)驗(yàn)用大鼠體重范圍在300 g左右的2月齡大鼠以及4月齡大鼠進(jìn)行對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)2月齡組大鼠電刺激致室顫過程中的血壓初始降到88.57±8.52 mmHg并維持在70.71±22.81 mmHg且波動(dòng)范圍很大，血壓值不能很好地穩(wěn)定在一個(gè)數(shù)值上；而4月齡組大鼠的血壓初始降到47.50±5.98 mmHg并在13.50±9.38 mmHg的范圍內(nèi)平穩(wěn)維持，我們推測(cè)4月齡組大鼠在致顫過程中更好的實(shí)現(xiàn)了低血壓維持，同時(shí)4月齡組大鼠在低血壓維持的基礎(chǔ)上，更易致顫且能在規(guī)定時(shí)間范圍內(nèi)成功復(fù)蘇，成模率遠(yuǎn)高于2月齡組大鼠。而2月齡組大鼠血壓在致顫過程中始終持續(xù)保持在正常血壓值的80%范圍內(nèi)，直至出現(xiàn)心搏驟停血壓才會(huì)驟降到25 mmHg。由此推斷，由于大鼠的生存時(shí)間在2～3年，故僅與常規(guī)選用的2月齡大鼠而言，只相差2個(gè)月的4月齡大鼠，心臟功能存在一定差異，在制備心肺復(fù)蘇模型上有一定的優(yōu)勢(shì)，穩(wěn)定，易操作，可控性強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)：2月齡大鼠與4月齡大鼠相比較： 模型組6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d的NDS總評(píng)分無(wú)顯著性差異。而神經(jīng)功能亞組評(píng)分：在網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)中4月齡與2月齡大鼠6 h、12 h、24 h、48 h評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義而72 h、7 d無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在平衡木實(shí)驗(yàn)中6 h、12 h、24 h 4月齡與2月齡大鼠有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義而48 h、72 h、7 d無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在懸崖回避實(shí)驗(yàn)中4月齡與2月齡大鼠均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在疼痛刺激實(shí)驗(yàn)中，4月齡與2月齡大鼠6 h、12 h有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義而24 h、48 h、72 h、7 d無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)以上結(jié)果推斷：NDS總評(píng)分不能夠準(zhǔn)確反應(yīng)大鼠腦損傷的程度，需利用神經(jīng)亞組評(píng)分或發(fā)掘其他方法進(jìn)一步評(píng)價(jià)神經(jīng)功能損失。大鼠心肺復(fù)蘇后24 h，運(yùn)動(dòng)平衡功能缺失的評(píng)價(jià)中4月齡組大鼠評(píng)分顯著低于2月齡組大鼠，感覺功能缺失的評(píng)價(jià)中，也存在4月齡組大鼠評(píng)分顯著低于2月齡組大鼠的現(xiàn)象，此特征進(jìn)一步提示我們4月齡組大鼠在致室顫過程中的低血壓維持狀態(tài)，造成的低灌注狀態(tài)，會(huì)加重腦損傷程度，從而體現(xiàn)在亞組神經(jīng)功能評(píng)分上；且進(jìn)行心肺復(fù)蘇模型的神經(jīng)功能缺失評(píng)價(jià)時(shí)，神經(jīng)功能亞組評(píng)分是很有必要的。

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