李曉娟，靳雪源，白冰珂，李 蓓，侯 俊，李瑞生

(1．解放軍第302醫(yī)院實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究保障中心，北京 100039；2．解放軍第302醫(yī)院國際肝病診療中心，北京 100039)

原發(fā)性肝癌是我國乃至全球的高發(fā)惡性腫瘤之一，死亡率很高[1]，目前仍缺乏有效的治療手段，因此闡明肝癌的發(fā)病機(jī)制對于研發(fā)新的藥物治療靶點(diǎn)具有十分重要的意義，而肝癌動物模型又是研究肝癌致病機(jī)理和抗癌新藥的重要平臺[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)磷脂酶Cε(PLCε)是癌基因產(chǎn)物Ras及抑癌基因產(chǎn)物Rap的新效應(yīng)蛋白[4]。Kataoka實(shí)驗(yàn)室利用敲基因技術(shù)建立了PLCε敲基因小鼠，并且發(fā)現(xiàn)PLCε-/-小鼠的皮膚乳頭瘤發(fā)生率明顯下降[5]。為了進(jìn)一步了解PLCε-/-小鼠的抗癌特性。本實(shí)驗(yàn)利用PLCε敲基因型(PLCε-/-)和野生型(PLC+/+)小鼠進(jìn)行肝內(nèi)注射的方法來建立移植性肝癌動物模型，以期再次驗(yàn)證PLCε-/-小鼠具有抗癌的特性，從而為深入研究肝癌致病機(jī)制提供了良好的研究平臺，也為臨床肝癌的新藥研發(fā)提供了新的研究方向。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

PLCε基因敲除小鼠由日本合作引進(jìn)到解放軍第302醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)室，該實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證【SYXK(軍)2012-0010】。隨機(jī)選取PLCε-/-(敲基因型)15只和PLCε+/+(野生型)小鼠30只，6～8周齡，單鼠體質(zhì)量(18～20)g，均為雄性。

1.2 細(xì)胞株制備

H22肝癌細(xì)胞株由中心實(shí)驗(yàn)室提供，將H22肝癌細(xì)胞株復(fù)蘇后腹腔接種于小鼠體內(nèi)，7 d后無菌抽取H22肝癌細(xì)胞株腹水，生理鹽水洗滌，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，生理鹽水調(diào)整癌細(xì)胞數(shù)至1×108/mL備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及肝癌模型制備

隨機(jī)選取15只PLCε+/+小鼠為對照組，選取15只PLCε+/+鼠為模型組I，15只PLCε-/-鼠為模型組II。造模方法：小鼠用速眠新(1 mg/kg)麻醉，仰臥位固定，備皮，在胸骨下緣2 cm處沿腹中線向上剪開皮膚約1 cm，分離并剪開腹膜，暴露肝臟，輕壓腹部擠出肝臟左葉，濕紗布墊于肝葉下方以保護(hù)，用注射器吸取H22細(xì)胞懸液0.2 mL，刺入肝被膜下的肝實(shí)質(zhì)內(nèi)，刺入深度約2～ 3 mm，緩慢注入后拔出針頭，用棉球輕壓注射部位，防止細(xì)胞外溢及出血。將肝臟回納入腹腔，縫合切口[6]。對照組以同樣的方法注入生理鹽水。術(shù)后正常采食飲水。

1.4 形態(tài)學(xué)觀察

術(shù)后需每日觀察各組小鼠的活動狀態(tài)，第15天處死全部小鼠，觀察模型組肝臟腫瘤生長情況，用游標(biāo)卡尺測量肝臟腫瘤長、短徑，按公式[7]計(jì)算腫瘤體積(V)：V=a × b2/2(a為長徑，b為短徑)。選取對照組正常肝臟組織與兩個(gè)模型組的肝臟腫瘤組織置入4%甲醛固定，石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對模型組I與模型組II的腫瘤體積進(jìn)行兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 PLCε敲基因小鼠肝移植瘤成功率分析

手術(shù)后各組小鼠狀態(tài)均良好。對照組、模型組I和II的小鼠均未出現(xiàn)死亡，存活率均為100%。在手術(shù)后第15天處死全部小鼠，開腹觀察，小鼠均未出現(xiàn)腹水。模型組I的15只小鼠肝臟表面全部有單個(gè)灰白色病灶，腫瘤移植成功率為100%。模型組II的15只小鼠有8只小鼠的肝臟表面有單個(gè)灰白色病灶，腫瘤移植成功率為53.3%(表1)。

2.2 PLCε敲基因小鼠肝移植瘤觀察分析

對照組小鼠肝臟外觀正常，未發(fā)現(xiàn)有結(jié)節(jié)病灶。模型組I的15只小鼠的肝臟表面全部有單個(gè)灰白色病灶，腫瘤體積平均為 (65.21±5.25)mm3。模型組II的15只小鼠中有8只小鼠的肝臟表面有單個(gè)灰白色病灶，腫瘤體積平均為 (23.46±3.47)mm3。模型組I的腫瘤平均體積明顯大于模型組Ⅱ(P<0.05)，(表1)，各組小鼠的肝臟外觀(圖1,見彩插2)。

表1 模型組小鼠肝癌腫瘤移植成功率及腫瘤體積分析

2.3 PLCε敲基因小鼠肝移植瘤組織形態(tài)學(xué)分析

光鏡下對照組小鼠肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)完整，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞胞漿均勻，無壞死和炎性浸潤。而模型I組和II組光鏡下可見腫瘤組織呈巢狀，肝小葉組織已經(jīng)完全破壞，腫瘤灶內(nèi)瘤細(xì)胞豐富，排列擁擠。瘤細(xì)胞異型性明顯，胞漿豐富，嗜酸性，核圓形，核仁清楚，核分裂像多見。局灶見壞死，瘤細(xì)胞間可見裂隙樣血管，部分瘤細(xì)胞圍繞血管生長，局部見瘤細(xì)胞侵犯血管壁(圖2，見彩插2)。

3 討論

原發(fā)性肝癌臨床上還缺乏有效的治療手段，因此建立一個(gè)優(yōu)質(zhì)的動物肝癌模型對于探索人類肝癌治療新方法有很大的價(jià)值和意義[8]。目前建立移植性小鼠肝癌動物模型方法主要有皮下移植和原位移植，皮下移植雖然制備過程簡單方便，易于觀察，但瘤細(xì)胞的生長環(huán)境與肝臟內(nèi)部腫瘤存在很大差異[9-10]。而肝癌的原位移植能夠較好地模仿人肝癌體內(nèi)的血供和生長環(huán)境，提供與肝癌病人相似的肝癌生物學(xué)特性，更好地反映出抗癌基因和藥物的藥效學(xué)指標(biāo)[11-12]。因此本實(shí)驗(yàn)采用原位移植的方法，以期建立PLCε敲基因小鼠移植性肝癌動物模型。

PLCε是PLC家族新成員，具有特異性的Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域和氨基端Ras鳥苷交換因子(GEF)結(jié)構(gòu)域[13]。Bai等[5]在化學(xué)致癌物誘導(dǎo)皮膚癌過程中發(fā)現(xiàn)PLCε-/-小鼠具有抑癌作用，姜泰茂等[14]研究發(fā)現(xiàn)化學(xué)誘導(dǎo)膀胱癌的過程中PLCε-/-小鼠也具有抑癌作用，提示PLCε可能參與了腫瘤的形成過程。因此本實(shí)驗(yàn)采用PLCε敲基因型(PLCε-/-)和野生型(PLCε+/+)小鼠進(jìn)行肝內(nèi)注射的方法來建立移植性肝癌動物模型并進(jìn)行對比分析，結(jié)果顯示PLCε+/+組和PLCε-/-組形成的肝臟腫瘤具有典型性，均呈單個(gè)灰色結(jié)節(jié)狀，而且病理結(jié)果顯示呈肝細(xì)胞癌病變。但PLCε-/-組的腫瘤移植成功率為53.3%，明顯低于PLCε+/+組的腫瘤移植成功率100%，而且PLCε-/-組的腫瘤體積也顯著小于PLCε+/+組(P<0.05)。由此可見，再次證實(shí)PLCε-/-小鼠具有抗癌特性，提示PLCε在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著非常重要作用。此結(jié)果與崔智[15]等采用化學(xué)致癌物誘導(dǎo)建立PLCε-/-小鼠肝癌模型的結(jié)果相一致，但本實(shí)驗(yàn)采用的肝內(nèi)移植方法建立的肝癌動物模型，顯著縮短了成模的時(shí)間，能夠更快速有效地為肝癌疾病的研究提供模型動物，這樣大大縮短了研究周期且提高了研究效率。

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