宣 佶，田耀洲，曹 鵬，胡春萍，蔡雪婷，張 偉

(1．南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046；2．解放軍81醫(yī)院，江蘇 南京 210002；3．江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210002；4.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210002；5. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院江蘇分院，江蘇 南京 210002)

肝纖維化是多種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)階段，阻斷肝纖維化是慢性肝病治療中的關(guān)鍵問(wèn)題[1]。為了更好地研究肝纖維化的發(fā)生機(jī)制以及藥物對(duì)該病的療效和治療途徑，需要建立穩(wěn)定、高效、可靠的肝纖維化動(dòng)物模型[2,3]。國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)對(duì)膽總管結(jié)扎模型建立的手術(shù)操作過(guò)程描述過(guò)于簡(jiǎn)單，不利于模型的復(fù)制，同時(shí)關(guān)于其造模成功率僅做了短期內(nèi)的統(tǒng)計(jì)和評(píng)價(jià)，無(wú)法反映動(dòng)物模型的遠(yuǎn)期可靠及穩(wěn)定性[3-5,7]，為此，筆者在研究膽汁淤積性肝硬化的藥物治療中，曾先后兩次建立膽汁淤積性肝硬化大鼠模型，本文擬報(bào)告造模過(guò)程，并探討一種方法簡(jiǎn)便、成功率高、存活時(shí)間長(zhǎng)、切實(shí)可行的造模方法。

1 膽總管結(jié)扎法

1.1 材料

清潔級(jí)SD大鼠40只由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)SCXK(滬)2007-0005；使用證號(hào)SYXK(蘇)2011-0017，雄性，體重(180±20)g，購(gòu)于南京青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)。

1.2 方法

SD雄性成熟大鼠40只，隨機(jī)分為膽總管模型組(n=30)和假手術(shù)組(n=10)，禁食禁水24 h。進(jìn)行稱(chēng)重，用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)，腹腔注射麻醉，仰位固定于固定板上，消毒切口，沿腹部正中線大鼠劍突以下約1．5～2 cm之間切口，打開(kāi)腹腔，找到胃幽門(mén)部，翻轉(zhuǎn)十二指腸，在十二指腸周?chē)械凵?lèi)似脂肪的就是胰腺；將胰腺展開(kāi)后在胰腺中仔細(xì)尋找透明的管狀物，該導(dǎo)管是從肝臟發(fā)出最后走行進(jìn)入十二指腸，內(nèi)有淡黃色液體，即為膽管。膽總管模型組暴露膽總管，于膽總管中段雙重結(jié)扎，查腹腔內(nèi)無(wú)活動(dòng)性出血后，常規(guī)關(guān)腹(圖1)。假手術(shù)組僅暴露膽總管，不予結(jié)扎，常規(guī)關(guān)腹。術(shù)后連續(xù)3 d注射青霉素40萬(wàn)U/只，禁水12 h，禁食24 h后正常喂養(yǎng)。術(shù)后1周眼眶取血檢測(cè)血清學(xué)指標(biāo)谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、白蛋白/球蛋白(A/G)，術(shù)后4周取膽總管結(jié)扎和假手術(shù)小鼠肝組織塊常規(guī)石臘切片，進(jìn)行HE染色，光鏡觀察；取肝組織塊經(jīng)SP法免疫組織化學(xué)染色。石臘切片經(jīng)梯度乙醇脫水，甲醇過(guò)氧化氫封閉后，分別用抗α-SMA mAb和抗CK-19 mAb 37℃孵育1 h，辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠的二抗，37℃孵育0.5 h，二氨基聯(lián)苯胺顯色。用PBS代替一抗做為陰性對(duì)照。計(jì)算機(jī)掃描分析蛋白的陽(yáng)性數(shù)目、灰度值和相對(duì)光密度。

1.3 結(jié)果

膽總管模型組大鼠術(shù)后尿黃，大便呈陶土色，但正常喂養(yǎng)后，膽總管模型組大鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡，腹脹腹水明顯，術(shù)后14 d隨機(jī)其中5只大鼠，抽取腹水以AMS酶法測(cè)定腹水淀粉酶，提示腹水淀粉酶明顯升高(表1)，假手術(shù)組大鼠術(shù)后無(wú)精神萎靡，無(wú)腹水，毛發(fā)有光澤，進(jìn)食進(jìn)水正常，大小便正常，體重逐日增加。一周眼眶取血行血清學(xué)指標(biāo) (AST、ALT、ALP、TBIL、DBIL、GGT) 檢測(cè)，對(duì)比假手術(shù)組模型組大鼠血清膽紅素明顯增高，肝功能異常(表2)，提示梗阻性黃疸模型成功，但是術(shù)后模型組相繼出現(xiàn)死亡，1月內(nèi)累計(jì)死亡20只，死亡率達(dá)66.7%，剖檢尸體發(fā)現(xiàn)胰腺壞死，大量腹水，腸道脹氣明顯。術(shù)后4周進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察，膽總管模型組病理提示散在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，匯管區(qū)小膽管明顯增生，纖維結(jié)締組織增生將肝小葉分割成假小葉結(jié)構(gòu)。免疫組化染色顯示，模型組肝臟匯管區(qū)小膽管周?chē)梢?jiàn)CK-19陽(yáng)性的棕褐色細(xì)胞明顯增生,肝組織α-SMA陽(yáng)性的棕褐色細(xì)胞明顯增多，成纖維細(xì)胞大量增生(圖2，見(jiàn)封三)，膽總管模型組CK-19、α-SMA蛋白的陽(yáng)性數(shù)目、灰度值和相對(duì)光密度表達(dá)水平升高(表3)。

2 肝門(mén)部肝總管縫扎法

2.1 材料

清潔級(jí)SD大鼠40只，雄性，體重(180±20)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，購(gòu)于南京青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng),合格證號(hào):SCXK(滬)2007-005；使用證號(hào)SYXK(蘇)2011-0017。

2.2 方法

SD雄性成熟大鼠40只，隨機(jī)分為肝總管模型組(n=30)和假手術(shù)組(n=10)，禁食禁水24 h。進(jìn)行稱(chēng)重，用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)，腹腔注射麻醉，仰位固定于固定板上，消毒切口，沿腹部正中線大鼠劍突以下約1.5～2 cm之間切口，打開(kāi)腹腔，暴露膽總管，沿膽總管向上找到肝門(mén)部，見(jiàn)此處無(wú)胰腺組織，拉鉤充分暴露術(shù)野，于肝總管近肝門(mén)部以5-0絲線單純縫扎，查腹腔內(nèi)無(wú)活動(dòng)性出血后，常規(guī)關(guān)腹(圖1)。假手術(shù)組僅暴露肝總管，不予結(jié)扎，常規(guī)關(guān)腹。術(shù)后連續(xù)3 d注射青霉素40萬(wàn)U/只，禁水24 h，禁食48 h后正常喂水，少量喂食，1周后正常喂養(yǎng)。術(shù)后1周眼眶取血行血清學(xué)指標(biāo)(AST、ALT、ALP、TBIL、DBIL、GGT、A/G)檢測(cè)，術(shù)后4周取膽總管結(jié)扎和假手術(shù)小鼠肝組織塊常規(guī)石臘切片，進(jìn)行HE染色，光鏡觀察；取肝組織塊經(jīng)SP法免疫組織化學(xué)染色,方法同上。

2.3 結(jié)果

肝總管模型組大鼠術(shù)后尿黃，大便呈陶土色，正常喂養(yǎng)后，無(wú)精神萎靡，一般情況良好，近期并無(wú)腹水腹脹等情況，假手術(shù)組大鼠術(shù)后無(wú)精神萎靡，毛發(fā)有光澤，進(jìn)食進(jìn)水正常，大小便正常，體重逐日增加。術(shù)后一周眼眶取血行血清學(xué)指標(biāo)(AST、ALT、ALP、TBIL、DBIL、GGT)檢測(cè)，對(duì)比假手術(shù)組模型組大鼠血清膽紅素明顯增高，肝功能異常，提示梗阻性黃疸模型成功，14 d后部分大鼠出現(xiàn)少量腹水，查腹水淀粉酶未見(jiàn)異常(表1),1月內(nèi)累計(jì)死亡8只，死亡率達(dá)26.7%。術(shù)后4周進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察，肝總管模型組病理提示散在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，匯管區(qū)小膽管明顯增生，纖維結(jié)締組織增生將肝小葉分割成假小葉結(jié)構(gòu)。免疫組化染色顯示，模型組肝臟匯管區(qū)小膽管周?chē)梢?jiàn)CK-19陽(yáng)性的棕褐色細(xì)胞明顯增生,肝組織α-SMA陽(yáng)性的棕褐色細(xì)胞明顯增多，成纖維細(xì)胞大量增生(圖2見(jiàn)封三)，肝總管模型組CK-19、α-SMA蛋白的陽(yáng)性數(shù)目、灰度值和相對(duì)光密度表達(dá)水平升高(表3)。

表1 腹水淀粉酶測(cè)定

表2肝功能生化指標(biāo)

Tab.2Biochemical indices of liver function

注：與假手術(shù)組比，* P<0.05；與膽總管模型組相比，# P > 0.05

表3 各組大鼠肝組織CK-19、α-SMA免疫組化染色的表達(dá)水平

3 討論

肝纖維化動(dòng)物模型在肝纖維化的發(fā)生機(jī)制以及藥物研究中應(yīng)用廣泛，方法多樣，膽總管結(jié)扎術(shù)是其中一種經(jīng)典造模方法，該模型的原理與發(fā)生在人體的繼發(fā)性膽源性肝硬化的機(jī)制相吻合，形成人為的肝外膽道梗阻，從而引起梗阻部位以上膽管擴(kuò)張、膽汁淤積、膽道內(nèi)壓力增高，并可引發(fā)肝內(nèi)膽小管擴(kuò)張破裂[5,6]，國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道該模型短期內(nèi)存活率在75%～83.3%之間[3-5,7]，但筆者發(fā)現(xiàn)該經(jīng)典方法造模后模型動(dòng)物1月內(nèi)死亡率仍然偏高，很難滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)藥物療效觀察。

筆者第一次造模，采用經(jīng)典的結(jié)扎膽總管法，死亡率較高，成本較大。觀察發(fā)現(xiàn)模型大鼠術(shù)后當(dāng)天一般情況可，并無(wú)死亡，術(shù)后第二天進(jìn)食進(jìn)水后，逐漸出現(xiàn)精神萎靡、腹部膨隆等情況，并且逐日加重，3 d后陸續(xù)出現(xiàn)死亡，期間抽取腹水查淀粉酶提示明顯增高，剖檢死亡大鼠發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)大量腹水，胰腺液化壞死，腸道明顯脹氣。結(jié)合大鼠體征、血液及腹水生化及剖檢結(jié)果，分析大鼠死亡原因考慮為急性胰腺炎可能性較大，進(jìn)而導(dǎo)致腹水淀粉酶明顯升高，剖檢時(shí)發(fā)現(xiàn)腸道脹氣也與胰腺炎引起的麻痹性腸梗阻有關(guān)。通過(guò)仔細(xì)研究大鼠膽道解剖及胰腺分布，發(fā)現(xiàn)大鼠膽總管于胰腺內(nèi)走行，且管腔十分纖細(xì)，不易尋找和暴露，術(shù)中對(duì)胰腺中膽管的牽拉、分離解剖、結(jié)扎都不可避免的造成一定的胰腺損傷，加之術(shù)后過(guò)早喂食，促進(jìn)胰腺分泌，進(jìn)一步加重胰腺壞死，最終造成模型動(dòng)物死亡。因此，筆者對(duì)第一次造模死亡率偏高主要原因總結(jié)為術(shù)中胰腺損傷和術(shù)后過(guò)早喂食刺激并加重胰腺壞死有關(guān)。

經(jīng)過(guò)仔細(xì)研究大鼠解剖結(jié)構(gòu)，筆者發(fā)現(xiàn)大鼠的肝總管位于左右肝管匯合部遠(yuǎn)心端，位置固定，易于尋找及暴露，且無(wú)胰腺組織包裹，于此處結(jié)扎膽道既可以有效阻斷膽道又可以減少損傷胰腺風(fēng)險(xiǎn)。因此第二次以肝門(mén)部肝總管縫扎法進(jìn)行造模，以眼科針穿5-0絲線(盡量減少周?chē)M織損傷)進(jìn)行單純縫扎，術(shù)中小心操作，最大限度的減少分離、結(jié)扎膽管造成的牽拉，避免損傷胰腺組織，造模后適當(dāng)推遲給水喂食時(shí)間，推遲并減少胰腺分泌。術(shù)后發(fā)現(xiàn)肝總管模型組的大鼠給食后無(wú)精神萎靡，一般情況良好，1周內(nèi)并無(wú)腹部膨隆飽脹等情況，術(shù)后第二周部分大鼠出現(xiàn)少量腹水，查腹水淀粉酶未見(jiàn)異常，考慮與肝硬化后影響蛋白合成有關(guān)造成的腹水有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中, 各組大鼠血液生化提示兩個(gè)模型組大鼠較假手術(shù)組膽紅素、轉(zhuǎn)氨酶等指標(biāo)明顯升高并伴有蛋白合成障礙；HE染色結(jié)果顯示散在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，匯管區(qū)小膽管明顯增生，纖維結(jié)締組織增生將肝小葉分割成假小葉結(jié)構(gòu)，同時(shí)我們利用膽管上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志-細(xì)胞角蛋白19 (CK-19)免疫組化染色提示,膽管上皮細(xì)胞明顯增生。以上結(jié)果均反映出兩組模型組大鼠肝臟功能受損、細(xì)胞炎性反應(yīng)、小膽管細(xì)胞增生明顯等一系列病理表現(xiàn)。另外，肝纖維化的顯著特征是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的增加和成分的改變，而肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化和增殖是其關(guān)鍵和中心環(huán)節(jié)[8-10]。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)是肝星狀細(xì)胞活化的特征性標(biāo)志物，免疫組化顯示兩組模型組大鼠肝臟α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加，提示成纖維細(xì)胞大量增生，進(jìn)一步證實(shí)膽道結(jié)扎后大鼠肝臟纖維化的病理改變。

因此本研究表明對(duì)于以上兩種造模方法均可以有效制造膽汁淤積性肝硬化動(dòng)物模型，但是前者死亡率較高，因此往往需要多次補(bǔ)做模型，時(shí)間和經(jīng)費(fèi)成本相對(duì)較大，而肝門(mén)部肝總管縫扎法，具有解剖位置固定、易于尋找和暴露、術(shù)后并發(fā)胰腺炎可能性小、成模率高、存活時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是一種切實(shí)、方便、可行的造模方法。筆者通過(guò)實(shí)驗(yàn)成功建立了膽汁淤積性肝硬化大鼠模型，對(duì)經(jīng)典的膽總管結(jié)扎造模方法進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)，降低了造模的死亡率，提高了肝纖維化模型質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)效率。

參考文獻(xiàn)：

[1] Iredale JP．Models of liver fibrosis：exploirng the dynamic nature of inflammation and repair in a solid organ [J]．J Clin Invest, 2007, 117(3):539-548．

[2] Weiler-Normann C，herkel J，Lohse AW．Mouse models of liver fibrosis [J]．Z Gastroentero1, 2007, 45(1):43-50．

[3] 秦冬梅, 趙文惠, 胡利萍, 等. 膽總管結(jié)扎術(shù)造大鼠肝纖維化模型的研究 [J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥， 2012, (04):27-29.

[4] 邵文武, 張輝. 膽總管結(jié)扎術(shù)誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型的建立 [J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué). 2010, 33(4):102.

[5] 林冬靜, 金政. 常用肝纖維化動(dòng)物模型的研究及評(píng)價(jià) [J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥， 2006, (03):189-190.

[6] Marques TG, Chaib E, Fonseca JH, et al. Review of experimental models for inducing hepatic cirrhosis by bile duct ligation and carbon tetrachloride injection [J]. Acta Cir Bras, 2012, 27(8):589-594．

[7] 元海成, 秦鳴放, 鄒富勝，等. 大鼠膽總管結(jié)扎后不同時(shí)間點(diǎn)的生化指標(biāo)變化 [J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合外科雜志， 2011, 17(6):583-585.

[8] Lee UE, Scott L. Friedman SL. Mechanisms of hepatic fibrogenesis [J]. Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2011, 25(2):195-206.

[9] Kisseleva T, Brenner DA. Mechanisms of fibrogenesis [J]. Exp Biol Med, 2008, 233(2):109-22.

[10] Henderson NC, Iredale JP. Liver fibrosis: cellular mechanisms of progression and resolution [J]. Clin Sci, 2007, 112:265-80.