王 洪，魏 杰，王吉星，李芳芳，岳秉飛

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.北京實驗動物行業(yè)協(xié)會，北京 100195)

小型豬是近年來生物醫(yī)學研究中應用最為廣泛的非嚙齒類實驗動物之一，在解剖學、生理學、疾病發(fā)生機理等方面與人相似性極高，具有其它實驗動物不可替代的優(yōu)越性[1-3]。小型豬和人的各器官系統(tǒng)不僅在形態(tài)上相似而且生理學功能也基本相同，特別是皮膚、心血管系統(tǒng)、胃腸道和泌尿系統(tǒng)尤其如此，因此在生物醫(yī)學研究中，小型豬越來越多地被用來替代犬、猴等非嚙齒類動物，小型豬更適合用于毒理實驗。小型豬是替代傳統(tǒng)非嚙齒類犬和猴的理想動物，將會在未來生物醫(yī)學研究中發(fā)揮日益重要的作用，而建立小型豬的實驗數(shù)據(jù)庫具有非常重要的現(xiàn)實意義[4，5]。我國小型豬種質(zhì)資源豐富，品種多樣，遺傳穩(wěn)定，具有體型小、易于飼養(yǎng)和操作等優(yōu)點，近年來小型豬實驗動物化進程不斷進展[6]。目前，已進行實驗動物化的品種有西藏小型豬，廣西巴馬小型豬，貴州小型豬，滇南小耳豬，五指山小型豬，版納微型豬，中國農(nóng)大小型豬等[7]。

血液生理、生化指標檢測及相關生物特性的研究是實驗用小型豬標準化研究的基本內(nèi)容，也是病理、生理以及毒理學研究工作的重要基礎指標和判定小型豬生理狀態(tài)的重要依據(jù)。[5]抗凝劑是在臨床和科學研究中經(jīng)常使用的化學藥劑。在血液細胞計數(shù)過程中，需要對血液進行抗凝處理。常用的抗凝劑有肝素鈉、EDTA鹽、檸檬酸鹽等[8]。

目前國內(nèi)對于抗凝劑對實驗用小型豬血液生理指標影響的報道極少，本研究中的房山封閉群小型豬來源于中國農(nóng)業(yè)大學培育的中國實驗用小型豬，引種后在北京房山區(qū)豬場按照封閉群繁育標準繁殖20多年。本研究探討了抗凝劑對白細胞計數(shù)，紅細胞計數(shù)，血紅蛋白含量和血小板含量等22項血液學生理指標的影響，并對使用不同抗凝劑得到的測定值進行比較分析，旨在為實驗用小型豬建群，疾病動物模型篩選和器官移植實驗提供基本的參考數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本

對小群體房山封閉群小型豬采抗凝血22份，分別為EDTA三鉀抗凝和肝素鋰抗凝，雌雄各半，樣品由北京市琉璃河科興實驗動物養(yǎng)殖中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2012-0005。小型豬年齡：成年，數(shù)量：22頭，性別：雌雄各半。該品種引種自背景來源清晰的中國農(nóng)大小型豬，在北京市琉璃河科興實驗動物養(yǎng)殖中心進行封閉繁育20多年。

1.2 主要儀器及設備

日本光電Mek7222血細胞分析儀

1.3 試劑

清洗液DH520，清洗液DH620，稀釋液DH640，溶血劑DH910, 溶血劑DH680均購自上海東湖生物醫(yī)學有限公司。EDTA-3K抗凝劑的濃度為15g/L，肝素鋰抗凝劑的濃度為1%。

1.4 測定項目及方法 [9]

血液生理指標：紅細胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白濃度(HGB)、紅細胞壓積(HCT)、平均紅細胞體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白(MCH)、平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細胞分布寬度(RDW)、白細胞計數(shù)(WBC)、白細胞分類計數(shù)、血小板計數(shù)(PLT)、平均血小板體積(MPV)、血小板壓積(PCT)和血小板分布寬度(PDW)，共22項。

用日本光電MEK-7222K血球分析儀測定，儀器精度：WBC 2.0%，RBC 1.5%，HGB 1.5%，MCV 1.0%，PLT 4.0%。樣品測定前后應進行空白測定。

2 結果

2.1 不同抗凝劑對血液生理指標的影響

共測定22項血液生理指標，其中1個指標MON有差異(P<0.05), MCV、MCHC、PLT、PCT、MPV、LYM、EOS、BAS、LYM %、MON%、EOS%和BAS%這12個指標差異有顯著性(P<0.01)，其他9項指標無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表1)。

2.2 EDTA三鉀抗凝血的血液生理指標結果

共測定22項血液生理指標，其中PLT、 NEUT和NEUT%3項指標有性別差異(P<0.05)， MON、EOS、MON%和EOS%4項指標性別差異有顯著性(P<0.01)；其他15項指標均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表2)。

表1 小型豬的血液生理參數(shù)

表2 小型豬EDTA三鉀抗凝的血液生理參數(shù)

表3 小型豬肝素鋰抗凝的血液生理參數(shù)

2.3 肝素鋰抗凝血的血液生理指標結果

共測定22項血液生理指標，其中PDW、NEUT和 LYM%3項指標有性別差異(P<0.05)，MON、EOS、MON%、NEUT%和EOS%5項指標性別差異有顯著性(P<0.01)；其他14項指標均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表3)。

3 討論

3.1 實驗動物血液生理指標的重要性

實驗動物的血液生理指標是生物醫(yī)學研究中重要的指標，是判斷健康動物狀態(tài)和選擇合格動物的標準，是病理學、毒理學等研究的重要參考依據(jù)。實驗動物血液生理參數(shù)主要受動物自身的遺傳因素與環(huán)境因素決定與控制。往往遺傳因素是決定實驗動物血液生理參數(shù)的內(nèi)在物質(zhì)基礎，環(huán)境因素是決定血液生理參數(shù)變化的外在條件。其中遺傳因素決定的大小，常常用遺傳度表示。某種動物的血液生理生化參數(shù)都有特定的波動范圍，這種范圍構成了每種實驗動物特有的生物學特性參數(shù)[10，11]。

3.2 兩種抗凝劑對血液生理指標的影響

分別用EDTA三鉀和肝素鋰抗凝的血液生理指標，該兩種抗凝劑對紅細胞計數(shù)的影響無差異，對平均紅細胞體積MCV和平均紅細胞血紅蛋白濃度MCHC的影響差異有顯著性；對血小板的相關參數(shù)的影響差異顯著；對白細胞計數(shù)無影響，但對白細胞分類的影響顯著，白細胞分類中，除了中性粒細胞外的，對淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞含量及其百分比都有顯著影響。如果實驗中主要考察的目標是白細胞分類的相關指標，或者血小板相關參數(shù)，那么在結果分析的時候，一定要考慮到抗凝劑對相關指標的影響。如果實驗中分多次采血取樣，那么應選用同一種抗凝劑，盡量減少不同的抗凝劑對血液生理指標的影響，避免由此帶來的實驗偏差。血液生理指標在不同抗凝劑之間存在一定的差異，在一定程度上說明，血液生理值除了受遺傳基因控制外，抗凝劑的種類對其血液生理指標的影響巨大。

3.3 性別差異對血液生理指標的影響

經(jīng)過EDTA三鉀處理的血液生理指標：血小板、中性粒細胞、單核細胞和嗜酸性粒細胞等指標有性別差異，且差異顯著；大多數(shù)指標差異無顯著性。說明血液生理值受遺傳基因控制，并且與不同性別生理代謝過程的差異有關系。經(jīng)過肝素鋰處理的血液生理指標：血小板、淋巴細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞存在性別間差異；大多數(shù)指標差異無顯著性，說明血液生理值受遺傳基因控制，并且與不同性別生理代謝過程的差異有關系。即使選用同樣的抗凝劑，血液生理指標在雌雄之間仍然存在差異，主要表現(xiàn)在血小板和白細胞分類上面。那么在實驗中，要考慮到性別差異對實驗結果的影響，同一個實驗中選取同一性別的動物。如果分不同批次，應保持不同批次間性別一致，以便于實驗結果的分析，排除干擾。

3.4 抗凝劑對血小板計數(shù)的影響

有報道稱EDTA鹽抗凝的人類血小板計數(shù)可能出現(xiàn)急劇下降的現(xiàn)象。邢輝等報道稱：“EDTA鹽有時可導致血小板發(fā)生聚集從而導致血液分析儀做血小板計數(shù)時出現(xiàn)假性偏低的現(xiàn)象?！眲⑶帙i等報道稱：“一些患者采用EDTA-K2抗凝血利用全自動血細胞分析儀檢測血小板計數(shù)時，會出現(xiàn)結果的假性異常降低?！倍椅墨I報道的數(shù)據(jù)顯示，出現(xiàn)這樣的病例在中國并不多見。通過我們的研究發(fā)現(xiàn)，無論是EDTA三鉀還是肝素鋰抗凝的小型豬血液樣本，均沒有出現(xiàn)血小板計數(shù)急劇下降的現(xiàn)象。[12-13]

3.5 血液生理指標中的敏感指標

無論用何種抗凝劑抗凝，小型豬雌雄之間的血液生理指標差異都出現(xiàn)在血小板和白細胞分類當中。說明血小板和白細胞分類是容易收到干擾并發(fā)生改變的敏感指標。雌雄之間的血液生理指標的差異不因抗凝劑的不同而有異，差異還是那幾個指標的差異。說明血液生理指標主要取決于遺傳因素，并存在性別差異。這種差別可能與動物的生長環(huán)境以及新陳代謝水平有關。

血液生理參數(shù)主要受動物自身的遺傳因素與環(huán)境因素決定與控制。遺傳因素是決定實驗動物血液生理參數(shù)的內(nèi)在物質(zhì)基礎，環(huán)境因素是決定血液生理參數(shù)變化的外在條件。因性別以及新陳代謝水平等因素的不同，動物往往表現(xiàn)出各異的生理參數(shù)。作為一類重要的實驗動物，小型豬的血液生理值在一定程度上反映了動物的新陳代謝和生理機能狀況，了解小型豬的生理指標對該動物的飼養(yǎng)管理以及實驗應用都具重要的參考價值。小型豬在血液生理方面的特性將有助于其在生物醫(yī)學領域的開發(fā)和利用[14-18]。

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