陳 璇，陳志永，徐 敏，范玉頂，劉澤軍，夏中曦，劉 彧，隗黎麗，鐘其旺

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌 330045； 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223)

魚類的血液在物質(zhì)運(yùn)輸、免疫防御、體液調(diào)節(jié)和維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，因此魚類的血液學(xué)研究一直倍受關(guān)注。血液學(xué)的研究內(nèi)容主要包括血細(xì)胞指標(biāo)[1-3]、生理生化指標(biāo)[4-6]、免疫指標(biāo)[7-9]和基因表達(dá)[10-11]等。由于大多數(shù)血液學(xué)參數(shù)的測定都需要在血液未凝集的狀態(tài)下進(jìn)行，因此抗凝劑是血液學(xué)研究中的常用試劑。目前，魚類中抗凝劑使用主要參照人血中的使用標(biāo)準(zhǔn)。常見的抗凝劑主要有ACD[12-13]、EDTA[14]、肝素[8，15]、草酸鉀[16]、草酸鹽[17]、檸檬酸鈉[18]，不同抗凝劑的抗凝機(jī)制各不相同，例如，肝素通過特異的戊糖序列與抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)結(jié)合，加強(qiáng)了ATⅢ對凝血因子FXa 和FⅡa 等的抑制作用，從而發(fā)揮抗凝作用[19]；ACD、EDTA、檸檬酸鈉、草酸鉀和草酸鹽則是通過與血液中鈣離子以不同的形式結(jié)合，降低鈣離子濃度，從而達(dá)到抗凝效果。然而抗凝劑的選用不當(dāng)可能會對一些實驗結(jié)果造成較大的干擾[20]，所以在血液學(xué)實驗中選擇合適的抗凝劑及合適的抗凝劑濃度是至關(guān)重要的。近年來只有少量研究關(guān)注魚類血液抗凝劑的選用[16，21]，大多數(shù)魚類中都缺乏相應(yīng)的選用標(biāo)準(zhǔn)，這極大地阻礙了魚類血液學(xué)的研究進(jìn)程。本文以黃鱔的外周血為研究對象，通過比較6種常用的抗凝劑在不同濃度和作用時間下的抗凝效果以及對血細(xì)胞存活率和總DNA含量的影響，以確定黃鱔血液學(xué)研究中所需的最優(yōu)抗凝劑及其有效濃度，并為其他魚類血液抗凝劑的選用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、肝素、氯化鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖、草酸銨、草酸鉀，以上所有試劑均為分析純(國藥集團(tuán))。臺盼藍(lán)染色液，北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)。黃鱔取自江西洪瑞黃鱔養(yǎng)殖場，魚體健康，體表無傷痕，體重為30～35 g。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度的抗凝劑配制

本研究采用的6種抗凝劑分別為肝素、EDTA、檸檬酸鈉、草酸鉀、草酸鹽、ACD。以0.8 %生理鹽水作為溶劑配制各種抗凝劑的母液，肝素(0.063%)、EDTA(4%)、檸檬酸鈉(16%)、草酸鉀(10%)、草酸鹽(4×：草酸銨48 g/L、草酸鉀32 g/L)和ACD(4×：檸檬酸19.2 g/L、檸檬酸鈉52.8 g/L、葡萄糖58.8 g/L)，4 ℃中保存，使用時用0.8 %生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋。

1.2.2 不同抗凝劑抗凝濃度的確定

用1 mL的無菌注射器從黃鱔的尾靜脈采血800 μL，分別取18 μL全血與2 μL各梯度濃度的抗凝劑進(jìn)行混勻，作為實驗組；另取18 μL全血與2 μL生理鹽水混勻，作為對照組?；旌虾蟮难獦佑?5 ℃中放置1 h、6 h、12 h和24 h后取出，觀察是否出現(xiàn)凝集成塊的現(xiàn)象。以上實驗重復(fù)三次。

1.2.3 不同抗凝劑對血細(xì)胞的影響及最佳抗凝濃度的確定

用1 mL的無菌注射器從黃鱔的尾靜脈采血，分別取18 μL全血與2 μL各梯度濃度的抗凝劑混勻，作為實驗組；另取18 μL全血與2 μL生理鹽水混勻，作為對照組。于4 ℃中放置1 h和24 h后，加入0.4 %臺盼藍(lán)溶液2.5 μL混勻，室溫靜置2～3 min后鏡檢計數(shù)。分別記錄不同抗凝劑內(nèi)5個視野中活細(xì)胞的數(shù)量和死亡細(xì)胞的數(shù)量，以血細(xì)胞的死亡率作為標(biāo)準(zhǔn)，確定其有效濃度。實驗進(jìn)行五次獨(dú)立重復(fù)。

細(xì)胞死亡率(%)=死細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%

1.2.4 不同抗凝劑對血液中總DNA含量的影響

分別取45 μL全血與5 μL最佳抗凝濃度的抗凝劑進(jìn)行混勻(終濃度：ACD：0.10×；EDTA：0.50‰：肝素：0.016‰；草酸鉀：0.63‰；草酸鹽：0.025×；檸檬酸鈉：8.00‰)，作為實驗組，于4 ℃中放置0、1、3和7 d后，分別混勻取血10 μL進(jìn)行基因組DNA的抽提。對照組為9 μL全血與1 μL生理鹽水混勻后立即進(jìn)行DNA的抽提。基因組DNA的抽提采用酚氯仿抽提法進(jìn)行，將抽提得到的DNA溶解于200 μL無菌去離子水中。用ThermoNanoDrop 2000超微量分光光度計對DNA的濃度和質(zhì)量進(jìn)行檢測。每種抗凝劑重復(fù)實驗三次。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

所得數(shù)據(jù)用Excle 2007進(jìn)行整理，運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Origin 7.5進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 不同抗凝劑的抗凝濃度

在生理鹽水對照組中，所有血液樣本均在1 h內(nèi)出現(xiàn)凝血現(xiàn)象。在實驗組中，不同抗凝劑均展現(xiàn)了良好的抗凝效果，但不同抗凝劑的抗凝濃度各不相同。如表1所示，當(dāng)ACD、EDTA、肝素、草酸鉀、草酸鹽和檸檬酸鈉的終濃度分別為0.025～0.40×、0.25～4.00‰、0.004 - 0.063‰、0.63～ 10.00‰、0.025 ～0.40×、1.00 ～16.00‰時，在24 h內(nèi)均能有效抗凝。

注：“+”表示血液凝固；“-”表示血液未凝固。

2.2 不同濃度抗凝劑對血細(xì)胞死亡的影響

顯微觀察時，死亡的血細(xì)胞在臺盼藍(lán)染色后呈藍(lán)色，出現(xiàn)細(xì)胞核變大、胞質(zhì)減少的現(xiàn)象，而活細(xì)胞則呈無色透明狀。實驗結(jié)果表明當(dāng)抗凝劑的濃度過高或過低時，均導(dǎo)致血細(xì)胞死亡率的上升，且隨著放置時間的延長，血細(xì)胞的死亡率呈現(xiàn)出不同程度的增加(表2)。通過對24 h內(nèi)血細(xì)胞死亡率的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，ACD、EDTA、肝素、草酸鉀、草酸鹽和檸檬酸鈉的最佳抗凝終濃度分別為0.10×、0.50‰、0.016‰、0.63‰、0.025×和8.00‰，其血細(xì)胞死亡率最低，分別為(1.87±1.55)%、(1.36±0.64)%、(1.55±0.69)%、(1.08±0.48)%、(1.62±0.53)%和(0.90±0.41)%，方差分析顯示最佳抗凝濃度下的六種抗凝劑在24 h的血細(xì)胞死亡率無顯著性差異(P>0.05，數(shù)據(jù)未顯示)。對照組血液于1 h內(nèi)出現(xiàn)凝固現(xiàn)象，故未進(jìn)行死亡率的測定。

表2 各種抗凝劑中黃鱔外周血血細(xì)胞的死亡率

注：表中不同字母表示在同一時間下同一種抗凝劑中各處理濃度間存在顯著性差異(P<0.05)；“*”表示同一種抗凝劑中不同時間點(diǎn)間細(xì)胞死亡率存在顯著差異(P<0.05)。

2.3 不同抗凝劑對血液中總DNA提取的影響

六種抗凝劑在最佳抗凝濃度下均具有良好的抗凝效果，7天內(nèi)均未出現(xiàn)凝血現(xiàn)象。通過酚氯仿抽提法獲得的DNA經(jīng)質(zhì)檢，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量良好，電泳檢測未發(fā)現(xiàn)明顯降解，且OD260/280=1.78-1.83，OD260/230=2.38-2.44，表明各種抗凝劑對血液DNA的提取質(zhì)量無明顯影響。但是，通過比較不同時間點(diǎn)各抗凝組與對照組的DNA含量發(fā)現(xiàn)，取血后立即抽提時(圖1，0 day)，實驗組與對照組間無顯著差異。但隨著放置時間的延長，實驗組中外周血的DNA總量都出現(xiàn)了不同程度的下降。其中，草酸鉀和草酸鹽組中DNA量在第一天開始出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)；ACD、EDTA和檸檬酸鈉組中DNA量在第7天才開始出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)；而肝素組中DNA含量雖有下降，但并不顯著(P>0.05)。

圖1 不同抗凝劑對黃鱔外周血DNA含量的影響Fig.1 Effects of different anticoagulants on contents of peripheral blood DNA

ACD：0.10×；EDTA：0.50‰：肝素：0.016‰；草酸鉀：0.63‰；草酸鹽：0.025×；檸檬酸鈉：8.00‰。圖中不同字母表示同一抗凝劑各處理間在P<0.05水平上差異顯著。

3 討論

本研究表明一定濃度的6種抗凝劑對黃鱔外周血均能產(chǎn)生良好的抗凝作用，這與此前在鯉中的研究結(jié)果一致[16]。雖然人血中的常用濃度也能使黃鱔外周血產(chǎn)生抗凝效果，但其與黃鱔中的最低抗凝濃度間仍具有一定差異，推測可能是由于兩者凝血機(jī)制的不同導(dǎo)致，例如，血小板膜磷脂的轉(zhuǎn)運(yùn)在哺乳動物的凝血中是必不可少的過程，但魚類在不含有血小板膜磷脂的情況下仍能發(fā)生凝血過程[22]。

通過對不同濃度抗凝劑進(jìn)行的血細(xì)胞死亡率的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，過高或者過低的抗凝劑濃度均會增加血細(xì)胞的死亡率。當(dāng)抗凝劑濃度過低時，可能會導(dǎo)致抗凝不徹底，產(chǎn)生肉眼無法辨別體積很小的血凝塊[23]。當(dāng)抗凝劑濃度過高時，可能會導(dǎo)致血細(xì)胞可能處于高滲的狀況中，并進(jìn)一步造成血細(xì)胞的死亡[24]，這表明滲透壓可能也是抗凝劑影響血細(xì)胞存活率的一個重要因素。另一方面，當(dāng)抗凝劑的濃度過高時，可能會對血細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性作用。目前，魚類血液學(xué)研究中常用的抗凝劑為0.1 %肝素[5,9,25]，而本實驗的結(jié)果表明肝素的最低抗凝濃度和最佳抗凝濃度分別為0.004‰ 和0.016‰，遠(yuǎn)低于通常的使用濃度0.1 %。若在黃鱔外周血中以0.1 %的肝素進(jìn)行抗凝，可能會由于使用的抗凝劑濃度偏高，導(dǎo)致血細(xì)胞產(chǎn)生較高的死亡率。除肝素外，ACD、EDTA、草酸鉀和草酸鹽的最佳抗凝濃度也低于人血中的使用濃度，而檸檬酸鈉在黃鱔外周血中的最佳抗凝濃度則高于人血中的使用濃度，這說明人血中的抗凝劑標(biāo)準(zhǔn)在魚類中一致性較差，魚類抗凝劑的使用仍需建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。

由于血液取材的便利性和連續(xù)監(jiān)測的可能性，所以血液是基因組獲取和基因檢測的良好材料。在麥穗魚(Pseudorasboraparva)和黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)中，相較于其他組織，血液抽提獲得的DNA含量相對較高[26-27]。通過比較六種抗凝劑對黃鱔血液DNA抽提的影響，表明血液提取的基因組DNA質(zhì)量良好，且9 μL全血抽提獲得DNA含量高達(dá)21.32 μg。同時，不同抗凝劑的短暫處理對DNA的質(zhì)量影響不大，但經(jīng)低溫保存一段時間后，抽提獲得的DNA含量均出現(xiàn)了不同程度的下降，含有ACD和EDTA的血液中DNA的含量下降最多，其次是草酸鹽、草酸鉀和檸檬酸鈉；而加入了肝素的血液中DNA的穩(wěn)定性最高，含量無顯著下降。這與之前關(guān)于冷凍保存的ACD和EDTA抗凝血DNA含量下降的報道吻合[13]。同時，在新疆卡拉庫爾羊中也發(fā)現(xiàn)肝素和檸檬酸鈉抗凝血中DNA的穩(wěn)定性較好[28]。盡管肝素抗凝血中DNA的穩(wěn)定性最佳，但由于肝素對DNA聚合酶具有較強(qiáng)的親和力，會抑制PCR反應(yīng)[29]，故不建議在分子實驗中使用。

4 結(jié)論

綜上所述，6種常見抗凝劑在黃鱔外周血中均能獲得良好的抗凝效果，且當(dāng)ACD、EDTA、肝素、草酸鉀、草酸鹽和檸檬酸鈉的終濃度分別為0.10×、0.50‰、0.016‰、0.63‰、0.025×和8.00‰時，對血細(xì)胞影響最小、抗凝效果最佳。肝素在六種抗凝劑中是血液提取基因組DNA的最適抗凝劑，但不推薦用于設(shè)有PCR反應(yīng)的實驗中；若保存的血樣后續(xù)需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增，更推薦使用草酸鹽或檸檬酸鈉進(jìn)行抗凝。