楊 柯，李 博，李紅瞻，辛亞平＊

（1.漢中市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，陜西 漢中723000；2.現(xiàn)代牧業(yè)寶雞分場(chǎng)，陜西 寶雞722300；3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌712100）

隨著社會(huì)的進(jìn)步，人們生活水平的提高，牛奶已成為人類重要的營(yíng)養(yǎng)食品之一，牛奶質(zhì)量直接關(guān)系到牛奶產(chǎn)品的質(zhì)量和銷售，進(jìn)而影響奶牛場(chǎng)、乳品廠的經(jīng)濟(jì)效益。對(duì)于牧場(chǎng)來說飼料原料中的黃曲霉毒素不僅對(duì)牛只自身造成嚴(yán)重的傷害，而且原料中包含的黃曲霉毒素更能直接在牛乳中體現(xiàn)出來。如果不能及時(shí)控制飼料原料中的黃素霉毒素的指標(biāo)、會(huì)直接影響奶牛場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。只有嚴(yán)格控制住牛奶的質(zhì)量，才能確保人們的健康及奶牛場(chǎng)的穩(wěn)定發(fā)展。

1 黃曲霉毒素的產(chǎn)生

黃曲霉生長(zhǎng)產(chǎn)毒的溫度范圍是12～42℃。最適產(chǎn)毒溫度為33℃，最適水分活性值為0.93～0.98。黃曲霉在水分為18.5%的玉米、稻谷、小麥上生長(zhǎng)時(shí)，第三天開始產(chǎn)生黃曲霉毒素，第十天產(chǎn)毒量達(dá)到最高峰，以后便逐漸減少。菌體形成孢子時(shí).菌絲體產(chǎn)生的毒素逐漸排出到基質(zhì)中。黃曲霉產(chǎn)毒的這種遲滯現(xiàn)象，意味著高水分糧食如在兩天內(nèi)進(jìn)行干燥.糧食水分降至13%以下。即使污染黃曲霉也不會(huì)產(chǎn)生毒素。

2 黃曲霉毒素的危害

2.1 黃曲霉毒素對(duì)人類的危害

黃曲霉毒素是一類主要由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，至今已分離出的黃曲霉毒素及其衍生物有20多種，黃曲霉毒素是一種強(qiáng)列的肝臟毒。對(duì)肝臟有特殊親和性并有致癌作用。它主要強(qiáng)烈抑制肝臟細(xì)胞中RNA的合成，破壞DNA的模板作用，阻止和影響蛋白質(zhì)、脂肪、線粒體、酶等的合成與代謝。干擾動(dòng)物的肝功能，導(dǎo)致突變、癌癥及肝細(xì)胞壞死。同時(shí)，飼料中的毒素可以蓄積在動(dòng)物的肝臟、腎臟和肌肉組織中，人食入后可引起慢性中毒。其中以黃曲霉毒素B1最為多見，危害性也最強(qiáng)，而牛奶檢測(cè)超標(biāo)的黃曲霉毒素MI則是黃曲霉毒素Bl的代謝產(chǎn)物。黃曲霉毒素Ml是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)，主要表現(xiàn)在致癌性和致突變性。對(duì)人及動(dòng)物肝臟組織有破壞作用.嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致肝癌甚至死亡。所以黃曲霉毒素1993年被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為一類致癌物。目前各個(gè)國(guó)家對(duì)各種食品中的黃曲霉毒素Bl以及黃曲霉毒素M1含量都有嚴(yán)格限制。

2.2 黃曲霉毒素對(duì)奶牛的危害

奶牛采食含黃曲霉毒素的飼料后多呈慢性經(jīng)過，犢牛生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，被毛粗糙逆立，食欲不振，磨牙，鼻鏡干裂，無目的地徘徊，常一側(cè)或雙側(cè)角膜混濁，有間歇性腹瀉。有的可導(dǎo)致里急后重和脫肛，犢牛對(duì)該毒素較敏感，個(gè)別牛還呈現(xiàn)驚恐或轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)等神經(jīng)癥狀。后期陷入昏迷而死亡，死亡率高于成年牛，成年奶牛對(duì)黃曲霉毒素敏感性較高，容易中毒。當(dāng)出現(xiàn)中毒時(shí)，心跳亢進(jìn)，食欲廢絕，精神萎頓，脈搏90次／min，呼吸頻數(shù)為13次／min以上。體溫正常，全身衰弱，行走搖擺，步伐不穩(wěn)，胃腸膨脹，消化紊亂.初期便秘，后變?yōu)橄铝　Ｈ鋭?dòng)音消失，可視黏膜蒼白，排綠色水樣糞便或糞便常伴有腸黏膜。糞便呈灰色，無治療效果，妊娠牛可發(fā)生早產(chǎn)或流產(chǎn)。

3 黃曲霉毒素的檢測(cè)

目前檢測(cè)黃曲霉毒素的方法主要有：薄層層析法、高效液相色譜法、以酶聯(lián)免疫為基礎(chǔ)的免疫分析法以及牛物傳感器法等，在此基礎(chǔ)上將不同方法進(jìn)行綜合應(yīng)用。黃曲霉毒素B1一般存在于不合格的飼料原料中，而黃曲霉毒素M1則是由于奶牛采食不合格的飼料原料，其中的黃曲霉毒素B1經(jīng)牛體代謝為M1。

3.1 飼料黃曲霉毒素B1檢測(cè)

現(xiàn)在牧場(chǎng)飼料黃曲霉檢測(cè)大部分都是ELISA方法檢測(cè)、即酶聯(lián)免疫吸附法。Celer AFLA B1 ELISA試劑盒用競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附法來測(cè)定黃曲霉毒素B1。

3.1.1 檢測(cè)原理 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)黃曲霉毒素B，的理論基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)，酶標(biāo)微孔板包被有針對(duì)黃曲霉毒素抗體的捕獲抗體，加入黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)或樣品溶液、黃曲霉毒素酶標(biāo)記物和黃曲霉毒素抗體，游離黃曲霉毒素與黃曲霉毒素酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)黃曲霉毒素抗體（競(jìng)爭(zhēng)性酶標(biāo)免疫分析），同時(shí)黃曲霉毒素抗體與捕獲抗體連接。沒有連接的酶標(biāo)記物在洗滌步驟中被除去，將基質(zhì)／發(fā)色劑加入到微孔中孵育，加入反應(yīng)停止液后，在波長(zhǎng)450nm處測(cè)量，吸收光強(qiáng)度與樣品濃度成反比。

3.1.2 藥品及試劑 ELISA試劑盒內(nèi)含預(yù)混合版、微孔板（包被有黃曲霉毒素B1抗體）、黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液（5瓶1.5mL的黃曲霉毒素B1藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0ppb、1ppb、5ppb、20 ppb、40ppb），酶耦合物、10倍濃縮沖洗液、發(fā)展液、終止液、蒸餾水、甲醇溶液、氯化鈉。

3.1.3 樣品處理 充分混勻原料樣品、細(xì)細(xì)研碎，稱取5g或50g研磨樣品、按5∶1加入1g或10g氯化鈉，加入25或250mL的用蒸餾水配制的甲醇溶液，充分震蕩3min。DDGS不需加入氯化鈉，但須震蕩15min。

3.1.4 檢測(cè)步驟 待測(cè)樣品做好標(biāo)記，建議做平行樣；使用多道槍吸取100μL的酶耦合物到每個(gè)預(yù)混合板中；加50μL的樣品和標(biāo)準(zhǔn)液到加好酶耦合物的預(yù)混合板中；使用多道槍對(duì)預(yù)混合板中的液體吸放三次混勻、然后立即取100μL的液體轉(zhuǎn)移到相對(duì)應(yīng)的包被有黃曲霉毒素B1抗體的微孔板中。每次加樣必須選用新的槍頭，避免感染；

室溫下培養(yǎng)10min；稀釋了10倍的洗液重復(fù)沖洗小孔；使用多道加樣槍吸取100μL發(fā)展液到每個(gè)小孔，室溫下培養(yǎng)5min；使用移液槍分別吸取50 μL的終止液到每個(gè)小孔中；在450nm光柵的酶標(biāo)儀下讀數(shù)。

3.1.5 結(jié)果分析 根據(jù)酶標(biāo)儀的數(shù)據(jù)判斷飼料中黃曲霉毒素的含量，企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)為：小于10為合格，10～15為限量使用，大于15表明原料中黃曲霉毒素過高超標(biāo)拒收處理。

3.2 牛奶黃曲霉毒素M1檢測(cè)

使用雙流向酶聯(lián)免疫法檢測(cè)牛奶黃曲霉毒素M1。

3.2.1 原理 利用酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)原理，樣品中殘留的黃曲霉毒素M1與定量特異性酶標(biāo)抗體反應(yīng)，多余的游離酶標(biāo)抗體則與酶標(biāo)板內(nèi)的包被抗原結(jié)合，通過流動(dòng)洗滌，加入酶顯色底物顯色后，與標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)比較定性。

3.2.2 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為GB／T 6682規(guī)定的二級(jí)水。黃曲霉毒素M1雙流向酶聯(lián)免疫試劑盒，2℃～7℃保存。包括黃曲霉毒素M1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，酶聯(lián)免疫試劑顆粒，抗黃曲霉毒素M1抗體，酶結(jié)合物，酶顯色底物。

3.2.3 儀器和設(shè)備 樣品試管，帶有密封蓋，內(nèi)置酶聯(lián)免疫試劑顆粒。移液器，450μL±50μL。酶聯(lián)免疫檢測(cè)加熱器，40℃±5℃，雙流向酶聯(lián)免疫檢測(cè)讀數(shù)儀。

3.2.4 分析步驟

①加熱器預(yù)熱到45℃±5℃，并至少保持15min。

②液體試樣或乳粉試樣復(fù)原后振搖混勻，移取450μL至樣品試管中，充分振搖，使其中的酶聯(lián)免疫試劑顆粒完全溶解。

③將樣品試管和酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒同時(shí)置于預(yù)熱過的加熱器內(nèi)保溫，保溫時(shí)間5min～6min。使試樣中的黃曲霉毒素M1和酶聯(lián)免疫試劑顆粒中的酶標(biāo)記黃曲霉毒素M1抗體結(jié)合。

④將樣品試管內(nèi)的全部?jī)?nèi)容物倒入試劑盒的樣品池中，樣品將流經(jīng)“結(jié)果顯示窗口”向綠色的激活環(huán)流去。

⑤當(dāng)激活環(huán)的綠色開始消失變?yōu)榘咨珪r(shí)，立即用力按下激活環(huán)按鍵。

⑥試劑盒繼續(xù)放置在加熱器中保溫保持4 min，使顯色反應(yīng)完成。

⑦將試劑盒從加熱器中取出水平放置，立即進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果判讀，結(jié)果判讀應(yīng)在1min內(nèi)完成。

3.2.5 結(jié)果分析 目測(cè)判讀結(jié)果，試樣點(diǎn)的顏色深于質(zhì)控點(diǎn)，或兩者顏色相當(dāng)，檢測(cè)結(jié)果為陰性。試樣點(diǎn)的顏色淺于質(zhì)控點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果為陽性。雙流向酶聯(lián)免疫檢測(cè)讀數(shù)儀判讀結(jié)果；數(shù)值≤1.05，顯示Negative，檢測(cè)結(jié)果為陰性；數(shù)值＞1.05，顯示Positive，檢測(cè)結(jié)果為陽性；陽性樣品需用第一法定量檢測(cè)方法進(jìn)一步確認(rèn)。

4 飼料黃曲霉毒素的控制措施

4.1 飼料原料的采購(gòu)入場(chǎng)管理

原料采購(gòu)是飼料企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)劣的第一關(guān)。想要提高奶牛場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益、必須從牛奶質(zhì)量做起、想要做好牛奶質(zhì)量、就必須要從飼料原料做起。采購(gòu)入場(chǎng)的飼料原料的好壞直接影響到奶牛健康及牛奶質(zhì)量、從而影響到牧場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。收購(gòu)原料時(shí)必須選擇質(zhì)量可靠地供應(yīng)商；原料入場(chǎng)前必須檢驗(yàn)原料的質(zhì)量。符合企業(yè)收購(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)方可入場(chǎng)允以卸貨。

4.2 飼料原料入場(chǎng)后的貯存

原料貯存也是一個(gè)重要問題，如果倉(cāng)庫(kù)漏水、陰暗、潮濕、老鼠出沒就很容易促使黃曲霉生長(zhǎng)，因而影響產(chǎn)品質(zhì)量。在原料貯存中，一定要注意空氣、濕度、溫度等的控制，要嚴(yán)格按照“先進(jìn)先出”的使用原則，要及時(shí)清理已被污染的原料?？墒褂玫姆椒ㄓ校嚎刂瀑A存環(huán)境的溫度、封閉隔氧貯存、氣調(diào)貯存、低溫通風(fēng)貯存及輻射法。

4.3 庫(kù)存原料的檢測(cè)

定期對(duì)牧場(chǎng)庫(kù)存的原料做抽檢，以免貯存時(shí)間過長(zhǎng)后發(fā)生霉變等因素對(duì)原料質(zhì)量產(chǎn)生影響。確保質(zhì)量合格后才能使用。

4.4 合理使用防霉劑

在潮濕和高溫季節(jié)加工的飼料原料與配合飼料極易發(fā)霉，應(yīng)用防霉劑，可延長(zhǎng)其保質(zhì)期。常用防霉劑主要是有丙酸或其鹽，山梨醇及其鹽類，雙乙酸鈉，延胡索酸等。其中又以丙酸及其鹽類（丙酸鈉、丙酸鈣）應(yīng)用最廣。另外有些防霉劑（如雙乙酸鈉）還可以提高飼料利用率，改善飼料的適口性，青貯添加劑（如液氨、丙酸、微生物培養(yǎng)物、或酶法青貯）有利于預(yù)防霉菌毒素的產(chǎn)生。

5 總結(jié)

食品安全一直是一個(gè)無處不在的話題，肉蛋奶做為人們?nèi)粘Ｉ畹谋匦杵?、尤其牛奶作為每天營(yíng)養(yǎng)的必需品，其質(zhì)量的安全更加關(guān)系到我們每個(gè)人的健康安全，所以加強(qiáng)牛奶質(zhì)量的安全管理顯得格外重要，黃曲霉毒素作為影響牛奶質(zhì)量的最重要的因素，更應(yīng)該把控好，只有這樣才能從根本上保證優(yōu)質(zhì)牛奶質(zhì)量和奶牛場(chǎng)健康發(fā)展。

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