關(guān)桂英 王風(fēng)朝

山東莘縣疾病預(yù)防控制中心檢驗科，山東莘縣 252400

食物中毒有很大一部分是因為食用細菌性食物，而在食物中毒時，如何快速準(zhǔn)確的檢測出病癥根源依舊是檢測機關(guān)開展工作的難點。傳統(tǒng)的診斷辦法是對吸入食物的殘留樣品進行細菌學(xué)培養(yǎng)觀察，最終得出結(jié)論，但是這種方式耗時長、資源消耗大，并且容易造成污染，另外檢測受到培養(yǎng)技術(shù)的過多局限，容易造成檢測結(jié)果不準(zhǔn)確等問題，常規(guī)PCR檢測只能針對性地檢測出單個細菌體，所以在涉及較多細菌時，其檢測的工作量較大，與傳統(tǒng)的檢測方式一樣存在缺陷，另外多重PCR檢測技術(shù)也由于其特異性和敏感性不高，同樣在食品檢測中存在不足，因此將以上兩種檢測方式結(jié)合，優(yōu)化PCR檢測流程和方式，使其能夠同時檢測致病的六種病菌，提高檢測效率的同時也保證了檢測的準(zhǔn)確性。本文正是基于此，對多重PCR檢測體系進行深入研究，具體研究成果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 試劑資料 實驗主要試劑為Taq酶、PCR緩沖液以及細胞裂解緩沖液，均購買于Promega公司。試劑盒為瓊脂糖DNA純化試劑盒，由青島生物科技公司制作，6對主要對引物均來自上海生物科技公司。

1.1.2 檢測儀器 包括Centri-fuge FRESCO 17低溫告訴離心機、DYY-6C電泳儀器、HDLⅡ生物安全柜、SPX-250B-Z培養(yǎng)箱、超純水以及凝膠成像系統(tǒng)。

1.1.3 菌種類型 包括蠟樣芽孢桿菌、腸炎沙門菌、大腸埃希菌、腸毒性大腸埃細菌、血性弧菌、葡萄糖細菌、副溶血性弧菌、福氏志賀菌，均由本市疾控中心提供。

1.2 一般方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 將沙門菌融于氯化鎂孔雀綠肉湯中，保持37°C的溫度持續(xù)培養(yǎng)1d；志賀菌接種于GN增菌液，保持37°C培養(yǎng)1 d；腸毒性大腸埃希菌與營養(yǎng)肉湯相接種，同樣維持37°C的溫度培養(yǎng)1d，副融血性弧菌與堿性蛋白胨水相接種，保持37°C培養(yǎng)18h，葡萄球菌與胰蛋白胨大豆肉湯，保持37°C培養(yǎng)1 d，蠟樣芽孢桿菌與胰酪胨大豆多黏菌素肉湯，保持37°C培養(yǎng)約20 h。

1.2.2 PCR引物設(shè)定 首先根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心建立的DNA序列數(shù)據(jù)庫明確6種微生物的DNA序列，利用DNA序列數(shù)據(jù)庫的眾多資源研究特異屬性，后開展靶序列選取，找到這6中致病細菌的對應(yīng)PCR引物，當(dāng)引物設(shè)計完成后利用Blast能夠計算兩個序列中具有相似性序列的功能，挑選出與DNA序列數(shù)據(jù)庫的同源性低于40%的PCR引物，并且保證兩者的特異性。

1.2.3 樣品采集 主要采集100例食物中毒患者的嘔吐、腹瀉物共計146份，還包括攜帶病菌的食物或飲品。

1.2.4 常規(guī)PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù) 首先保持溫度在95°C，持續(xù)3min，單個循環(huán)過程溫度保持94°C，時長30 s，一共反映35個循環(huán)，待58°C時?；? min，而72°C時延伸1min，等循環(huán)完成后，延伸10min，使溫度下降至16°C，4°C時存儲產(chǎn)物，以便于下次使用。利用凝膠成像系統(tǒng)和3%瓊脂糖凝膠電泳檢查5 μL PCR產(chǎn)物，剩下的均4°C進行保存。

1.2.5 常規(guī)PCR退火溫度控制 基于6種主要致病細菌的退火溫度設(shè)定PCR反應(yīng)的退火溫度范圍在50～62°C，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，后通過電泳圖條帶的亮度反映來控制退火溫度。

1.2.6 多重PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù) 保持95°C下預(yù)變性3 min，持續(xù)40個循環(huán)，每一循環(huán)維持 94°C 變性 30s，62°C ?；?1 min，同樣于72°C時延伸1 min，40個循環(huán)均完成后延伸10 min，待其冷卻到16°C，4°C時存儲產(chǎn)物，同樣利用凝膠成像系統(tǒng)和3%瓊脂糖凝膠電泳檢查5 μL PCR產(chǎn)物，剩下的均4°C進行保存。

1.2.7 多重PCR退火溫度控制 以腸毒性大腸埃細菌、蠟樣芽孢桿菌以及副溶血性弧菌為例，基于多重PCR反應(yīng)系統(tǒng)設(shè)計以上三種病菌類型的退火溫度為48～72°C，同樣使用瓊脂糖凝膠電泳檢測方式，根據(jù)電泳圖條帶呈現(xiàn)的亮度情況選擇適當(dāng)?shù)耐嘶饻囟取?/p>

1.2.8 常規(guī)以及多重PCR檢測敏感度對比 測定選取的葡萄球菌、腸炎沙門菌和蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA濃度，并且使其變?yōu)?0ng/μL，并且進行十倍稀釋，保證敏感度測驗的DNA濃度在 2×10-2～2×10-10ng/μL， 后在每個濃度中各選擇 2μl進行常規(guī)以及多重PCR檢測對比。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)PCR檢測與多重PCR檢測靈敏度對比結(jié)果

通過常規(guī)PCR檢測和多重PCR檢測的敏感度比較，經(jīng)過10倍稀釋后的葡萄糖菌、蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA、腸炎沙門菌得知，常規(guī)PCR在DNA含量較低的情況下仍舊可以反映出清晰特異性的目的條帶，而多重PCR只能擴增出葡萄球菌以及蠟樣芽孢桿菌，當(dāng) DNA 濃度低于 2×10-2～2×10-1ng/μL 時，無法檢測出蠟樣芽孢桿菌，而低于 2×10-2～2×10-3ng/μL 時，只等對葡萄球菌進行擴增，DNA 濃度不高于 2×10-2～2×10-7ng/μL 時候無法擴增。由此得知常規(guī) PCR 檢測敏感度為 2×10-2～2×10-7ng/μL，多重PCR的檢測敏感度是 2×10-2～2×10-6ng/μL。

對100例患者146份食品中毒樣本進行以上兩種檢測，發(fā)現(xiàn)副溶血性弧菌均可檢測出來，但是兩種PCR檢測對比分析后，常規(guī)PCR能從較多的樣品中檢測出這一細菌，而多重PCR檢測相比而言從樣品中檢測出副溶血性孤菌的概率較低。

2.2 常規(guī)PCR、多重PCR退火溫度優(yōu)化

常規(guī)PCR反應(yīng)在退火溫度不高的的情況下，例如50°C的退火溫度，6種主要致病菌都能反映出特異性擴增條帶，但條帶亮度呈現(xiàn)效果不明顯，而當(dāng)溫度較高，處在58°時反應(yīng)出的電泳條帶更為清晰，因此可以說溫度較高的情況下達到的PCR檢測結(jié)果也更為滿意。但是溫度過高，即到達62°C時，葡萄球菌產(chǎn)物反應(yīng)不明顯，并且容易導(dǎo)致腸炎沙門菌產(chǎn)物丟失。所以根據(jù)分析發(fā)現(xiàn)常規(guī)PCR檢測保持58°C的退火溫度能達到最好的檢測效果。

根據(jù)對蠟樣芽孢桿菌、副溶血性孤菌以及腸出血性大腸埃希菌三種菌種的引物檢測為例進行的多重PCR檢測退火實驗得知：多重PCR檢測在退火溫度為50°C時，以上三種致病菌的特異性擴增條帶反映效果一般，僅能體現(xiàn)很低的條帶亮度，但當(dāng)溫度到達62°C時，電泳條帶的亮度反映情況良好，便于分辨，得到的PCR檢測結(jié)果也更為確切。當(dāng)溫度到達70°C時，蠟樣芽孢桿菌引物會發(fā)生丟失，所以得出多重PCR檢測退火溫度在62°C時效果最佳的結(jié)論。

3 結(jié)語

由以上檢測結(jié)果得知，傳統(tǒng)的檢測方式對于一些特殊病菌的培養(yǎng)和檢測存在技術(shù)盲區(qū)，同時有敏感度弱、特異性低、檢驗工作量大、檢測時間長等眾多缺陷，難以滿足對病菌食物起到檢測和預(yù)防的目的，所以具有眾多優(yōu)勢的多重PCR檢測方式亟需進一步使用和優(yōu)化。多重PCR檢測技術(shù)首先應(yīng)用于異基因臍帶血干細胞治療假肥大型肌營養(yǎng)不良癥中。目前多重PCR診斷技術(shù)已經(jīng)普遍用于基因組結(jié)構(gòu)、基因座定位或者病源細菌檢測等多種用途中，并且通過長時間的使用，其檢測質(zhì)量也得到的肯定，尤其是能夠檢測出副溶血性孤菌、單核細胞增生李斯特菌以及沙門菌方面能夠在保證檢測質(zhì)量的前提下縮短檢測耗時。

通過以上實驗研究得知常規(guī)PCR檢測的敏感度在2×10-7ng/μL，所以高于多重PCR檢測的敏感度，對于食物中含有的病菌檢測也較為有效，但是消耗大量的試劑以及時間。多重PCR檢測與其相反，雖然靈敏度不如常規(guī)PCR檢測，但是能夠縮短檢測時間，并且能夠同時檢驗出多種類病菌類型，所以將常規(guī)PCR檢測與多重PCR檢測相結(jié)合，取長補短的優(yōu)化檢測方式，建立一個具備高效、敏感、準(zhǔn)確的PCR檢測方式，能夠使6中治病的主要病菌類型在最快時間內(nèi)被全部檢測出來。

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