詹 飛，李 燦，李瑞生，張玉潔

0 引言

白血病是兒童時期最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率占兒童惡性腫瘤的第一位。急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)約占兒童急性白血病的20%，盡管目前對兒童ALL的療效不斷提高，但仍有20%～30%兒童的ALL出現(xiàn)復(fù)發(fā)且通常復(fù)發(fā)后預(yù)后不良，因此，尋找新的抗腫瘤藥或化療增敏劑，有助于改善AML的療效[1-2]。

消瘤平是由柴胡、炙甘草、黃芩、大棗、法半夏、黨參6味中藥材提取而制成，柴胡和解少陽，疏肝利膽，通達表里；黃芪、黨參為補中益氣藥，黃芪健脾益氣；法半夏調(diào)和肝胃(脾)，炙甘草調(diào)和諸藥，并提高免疫功能。同時，柴胡歸屬肝經(jīng)，通過調(diào)節(jié)肝經(jīng)的功能以助血滋生[3-4]，因此，消瘤平具有增強機體免疫能力及抗腫瘤的作用。本研究以人淋巴系白血病細胞株HL-60為研究對象，觀察消瘤平對該細胞生長、凋亡及凋亡相關(guān)基因蛋白的影響，以探討消瘤平抗白血病的可能作用機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器 潔凈工作臺(上海凈化設(shè)備廠)；1815TC型CO2培養(yǎng)箱(美國SHEL-LAB產(chǎn)品)；MK3型酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo Labsystems)；流式細胞儀FACS Calibur(Becton Dickinson公司)；計算機數(shù)據(jù)處理軟件CELLQUEST(B.D.公司)；低速離心機(日本KUBOTA)。

1.2 藥物與試劑 采用水煎法制得消瘤平糖漿劑，HPLC法測得消瘤平中黃芪苷含量為2.32 mg/mL，批號：120315；胎牛血清(德國PAA產(chǎn)品)；RPMI1640培養(yǎng)液(GIBCO產(chǎn)品)常規(guī)溶解，過濾除菌，分裝后4 ℃保存，使用時加入10%胎牛血清、青霉素和鏈酶素各100 mL，5%NaHCO3調(diào)pH值為7.2，即為RPMI1640完全培養(yǎng)液；溴化二甲噻唑二苯四氮(MTT，Sigma 產(chǎn)品)；碘化丙啶(PI，Sigma公司)；Caspase-3、Fas、Bcl-2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(GDB公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 細胞株 人白血病細胞株HL-60細胞由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院提供，用含20%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 將人白血病HL-60細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用胰蛋白酶消化后按1∶3的比例傳代，每3 d傳代1次，取處于對數(shù)生長期的細胞用于試驗研究。

2.2 MTT法檢測對人白血病細胞生長的影響 取處于對數(shù)生長期的HL-60細胞，按常規(guī)制成1×105個/mL細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。將消瘤平溶解于1640培養(yǎng)液中，分別加入96孔培養(yǎng)板，使最終每組含消瘤平濃度分別為：10、20、40、80、160、320 μg/mL，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，空白對照組加等量1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后24、48、72 h 3個時相各取出1塊96孔板進行MTT比色實驗：每次于實驗結(jié)束前從各孔中吸出100 μL上清棄去，加入MTT 10 μL(終濃度5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入DMSO 100 μL終止反應(yīng)，振蕩10 min，使充分溶解，用酶標(biāo)儀于波長570 nm處測定各孔吸光度值(A)。按公式“(1-藥物孔A值/對照孔A值)×100%”計算細胞抑制率，以劑量和抑制率繪制生長曲線。

2.3 流式細胞術(shù)檢測對細胞凋亡和周期的影響 將處于對數(shù)生長期的HL-60細胞以1×106個/mL密度接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的消瘤平和陽性對照藥順鉑，對照組加入等量培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細胞培養(yǎng)上清液，置-20 ℃環(huán)境待測相關(guān)基因蛋白；常規(guī)處理細胞后，用70%預(yù)冷乙醇固定細胞，置4 ℃環(huán)境中待測細胞凋亡率和細胞周期。檢測前，先離心棄上清，再用PBS洗滌后置于檸檬酸緩沖液中1 h以上，調(diào)整細胞濃度至1×106個/mL左右，離心棄上清液，加入1 800 μL胰酶消化液，充分作用后加入1 500 μL胰酶抑制酶液(RNASE)，作用數(shù)分鐘后加入1 500 μL碘化丙啶溶液，15 min后用200目尼龍網(wǎng)過濾，采用美國B&D公司流式細胞儀進行檢測細胞凋亡率并分析細胞周期。

2.4 ELISA法檢測對凋亡相關(guān)基因蛋白的影響 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測凋亡相關(guān)基因蛋白。取“2.3”中凍存的細胞培養(yǎng)上清，按Caspase-3酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書進行操作，建立標(biāo)準曲線：設(shè)標(biāo)準孔8孔，每孔加入樣品稀釋液100 μL，第1孔加標(biāo)準品100 μL，混勻后吸出100 μL移至第2孔。如此反復(fù)做對倍稀釋至第7孔，最后，從第7孔吸出100 μL棄去，第8孔為空白對照。待測樣品孔加入裸鼠血清100 μL，將板置37 ℃反應(yīng)120 min。用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，用吸水紙拍干。每孔加入第一抗體工作液100 μL，使充分混勻后置37 ℃反應(yīng)60 min。用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，加入酶標(biāo)抗體工作液100 μL，37 ℃反應(yīng)60 min，洗板同前。加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗處反應(yīng)5～10 min，再加入50 μL終止液混勻，酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm處測吸光度，繪制標(biāo)準曲線，并計算Caspase-3含量。同法檢測Fas和Bcl-2的含量。

3 結(jié)果

3.1 消瘤平對HL-60細胞生長的抑制作用 倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)消瘤平作用后的細胞排列稀疏，且隨著作用時間的延長和藥物濃度的增加，細胞密度逐漸減少。不同濃度組的消瘤平對HL-60細胞的增殖均有一定的抑制作用，各藥物濃度組細胞生長抑制率與同時間點對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且隨著作用時間的延長，與同濃度組相比抑制率上升，因此，可見消瘤平體外對HL-60細胞的生長抑制作用具有濃度和時間依賴性。具體結(jié)果見圖1。

3.2 消瘤平對HL-60細胞凋亡的影響 40、80、160 μg/mL消瘤平作用于HL-60細胞后，細胞凋亡率分別為22.37%、31.25%和53.42%，明顯高于對照組，隨著劑量的增加，細胞凋亡率明顯增加，并出現(xiàn)凋亡典型性特征峰。結(jié)果見表1。

圖1 消瘤平對HL-60細胞增殖的抑制作用

表1消瘤平對HL-60細胞凋亡的影響(n=3)

注：與細胞對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.3 消瘤平對HL-60細胞周期的影響 消瘤平作用于細胞48 h后，細胞周期均受到不同程度的影響，與對照組相比，3個劑量組G2-M期細胞比例均增加，高、中劑量組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨著藥物劑量的增加，G2-M期的比例也增加；G0-G1期和S期略有減少，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示消瘤平可通過阻滯G2-M期，從而抑制白血病細胞的生長，見表2。

表2 消瘤平對HL-60細胞周期的影響(n=3)

3.4 消瘤平對凋亡相關(guān)基因蛋白Caspase-3、Fas和Bcl-2含量的影響 消瘤平3個劑量均可促進Caspase-3蛋白的表達，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；高劑量組Fas蛋白表達顯著高于對照組，Bcl-2蛋白表達則明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 消瘤平對HL-60細胞Caspase-3、Fas和Bcl-2蛋白表達的影響

4 討論

急性髓細胞白血病是一類來源于造血干細胞的惡性克隆性疾病，隨著化學(xué)治療新藥、干細胞移植與生物療法的開展，急性白血病的治療取得很大進步[5-6]。但有一部分患者雖經(jīng)過各種化療藥物治療仍無法完全緩解，或緩解后在短期內(nèi)復(fù)發(fā)，即為難治性白血病。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移與機體的免疫功能(特別是抗腫瘤能力)低下有關(guān)[7]。中藥治療惡性腫瘤，通過扶正祛邪，可增強機體免疫功能，減輕患者放療、化療后的臨床癥狀，提高患者術(shù)后生存質(zhì)量，有較明確的抗復(fù)發(fā)效果[8]。因此，國內(nèi)外許多學(xué)者試圖從天然藥物中尋找能有效抑制惡性腫瘤細胞增殖的藥物或其活性成分用于治療白血病。

腫瘤患者接受化療后，常出現(xiàn)燥熱傷津所致的陰虛內(nèi)熱或氣陰兩虛，治以滋陰潤燥清熱或益氣養(yǎng)陰中藥而取效[9]。消瘤平糖漿劑是由柴胡、炙甘草、黃芪、大棗、法半夏、黨參6味中藥制成，已有研究表明[10]，消瘤平對環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下的小鼠有明顯的改善作用，提示其可減輕化療藥物的副作用，在腫瘤輔助治療中具有一定的應(yīng)用前景。本實驗采用MTT法觀察消瘤平對白血病HL-60細胞生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)消瘤平體外可有效殺傷人白血病細胞HL-60，明顯抑制其增殖，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，濃度越高，抑制作用越強，且隨著作用時間的延長，抑制作用也增強，提示消瘤平注射液具有明顯的抗白血病活性，作用呈現(xiàn)劑量依賴性。

腫瘤的發(fā)生不僅與細胞過度增殖有關(guān)，還與細胞的死亡速度減慢有關(guān)，腫瘤發(fā)生的過程必定伴有細胞凋亡這一主動而有序的細胞自我消亡過程[11-12]。在正常情況下，細胞增殖與凋亡保持平衡，當(dāng)細胞正常增殖和分化被打亂，導(dǎo)致細胞過度增殖和異常時，就會誘發(fā)疾病。凋亡不僅直接影響機體組織的正常發(fā)育、分化與死亡，其在腫瘤治療中的作用也受到重視。細胞周期(Cell cycle)是指連續(xù)分裂的細胞從一次分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的整個連續(xù)過程，可分為4個周期：S期、G2期、M期、Gl期。

藥物抗腫瘤作用機制多與藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡密切相關(guān)。參與細胞調(diào)控的基因很多，Bcl-2是目前凋亡機制研究的主要靶分子，是重要的凋亡抑制基因，其表達升高，細胞趨向成活。Bcl-2在腫瘤組織中的表達明顯高于正常組織，一方面可以阻止腫瘤細胞凋亡，增加惡性細胞數(shù)量，另一方面可使正常細胞原癌基因激活，導(dǎo)致細胞惡性化[13-14]。Caspase蛋白家族處于細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中心位置，而Caspase-3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的核心效應(yīng)分子，是最重要的效應(yīng)性蛋白裂解酶，在許多腫瘤中過度表達，能導(dǎo)致細胞發(fā)生一系列凋亡和生化改變[15]。在出現(xiàn)細胞受刺激、損傷或接到死亡指令等信號時，Caspase家族被激活，激活的Caspase-3能裂解大量的底物，包括抗凋亡成分及結(jié)構(gòu)或蛋白，并誘導(dǎo)白血病細胞凋亡。Fas蛋白屬Ⅰ型跨膜蛋白，是腫瘤壞死因子超家族成員，廣泛表達于人體組織，當(dāng)膜表面Fas蛋白與其配體FasL結(jié)合后，導(dǎo)致Fas空間構(gòu)象改變，引起死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體形成，進而激活Caspase家族，啟動蛋白級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞凋亡[16-17]。

細胞凋亡激活信號通路十分復(fù)雜，不同信號分子之間相互聯(lián)系，Bcl-2可抑制Caspase-3激活，從而抑制細胞凋亡；Bcl-2也是Caspase-3的底物，可被切斷而失去抗凋亡的能力。本研究根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，分別用40、80、160 μg/mL的消瘤平處理細胞，結(jié)果表明，HL-60細胞凋亡率與消瘤平濃度呈正相關(guān)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；周期變化也與消瘤平的濃度有關(guān)，依次加入不同濃度消瘤平后G2-M%明顯升高，而G0-G1%和S%略有降低。ELISA法檢測結(jié)果顯示，不同濃度消瘤平作用后，HL-60細胞Caspase-3蛋白表達隨著藥物濃度的增加有增高趨勢。高濃度還促進Fas蛋白的表達，而Bcl-2蛋白表達低于對照組。提示消瘤平可能通過將HL-60細胞阻滯在G2-M期，上調(diào)Caspase-3和Fas蛋白，下調(diào)Bcl-2蛋白，促進細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖，進而達到抗腫瘤作用，具體機制還有待于進一步研究。

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