楊 君，梁慧敏，丁平田，楊躍輝

0 引言

兩親性嵌段共聚物在選擇性溶劑中自發(fā)形成具有核-殼結(jié)構(gòu)的膠束，其疏水內(nèi)核可作為難溶性藥物存儲，能夠增大藥物溶解度，而親水外殼則形成膠束聚集體的空間屏障，保證其在水性環(huán)境中的穩(wěn)定性。膠束的上述優(yōu)點(diǎn)拓展了口服給藥新途徑。如果能將共聚物膠束制備成口服給藥形式，就可以實(shí)現(xiàn)在增大藥物溶解度的同時(shí)提高藥物胃腸道內(nèi)穩(wěn)定性，從而實(shí)現(xiàn)方便給藥與提高藥物生物利用度的雙重目的[1-4]。此外，口服膠束還具有減少藥物對胃腸道正常細(xì)胞毒性、降低對胃腸道刺激性的優(yōu)點(diǎn)。

硝苯地平(Nifedipine)是第一代鈣拮抗劑，為抗高血壓、防治心絞痛的藥物，治療效果顯著。硝苯地平屬于生物藥劑學(xué)分類中的第二類藥物，生物通透性好，但因溶解性較差(室溫下溶解度約為10 μg/mL)，生物利用度低，給藥物臨床應(yīng)用帶來諸多不便。本文以硝苯地平為模型藥物，以自制兩親性嵌段共聚物 mPEG-b-PCL為載體，制備單甲基醚聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-硝苯地平(mPEG-b-PCL-nifedipine)口服膠束，并對膠束的外觀、形態(tài)、粒徑、體外釋放等制劑學(xué)性質(zhì)進(jìn)行考察，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 BS 110 S型分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；KQ-50B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Nicomp-380 粒度測定儀(美國Particle Sizing Systems公司)；JEM-I200EX 透射電鏡[日本電子公司(JEOL)]；透析袋(MWCO=3 500)，濟(jì)南西美貿(mào)易有限公司；高效液相色譜儀(日本島津，SPD-10A VP檢測器，LC10-AT VP泵)。

1.2 試藥 硝苯地平原料藥(自制)；mPEG-b-PCL聚合物(自制)；甲醇(色譜純，江蘇漢邦科技有限公司)；乙腈(色譜純，山東禹王集團(tuán))；磷酸二氫鈉，二水(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；磷酸氫二鈉，十二水(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；0.05 M磷酸鹽緩沖液(氯化鈉 8 g，氯化鉀0.2 g，磷酸氫二鈉1.44 g，磷酸二氫鉀0.24 g，調(diào)pH 至7.4，并定容至1 L)。

2 聚合物載藥膠束的制備

稱取一定量的共聚物和藥物共溶于兩者的良溶劑中，劇烈攪拌下緩慢滴加一定體積重蒸水，攪拌平衡2 h，然后在一定溫度下?lián)]發(fā)有機(jī)溶劑。待有機(jī)溶劑完全去除后，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得到載藥膠束樣品。

3 方法與結(jié)果

3.1 外觀 自制的mPEG45-b-PCL25-nifedipine 與mPEG114-b-PCL61-nifedipine聚合物膠束溶液均為無色澄清透明液體，流動(dòng)性好，肉眼觀察未見不溶性成分或絮狀聚集物。加蒸餾水適當(dāng)稀釋后外觀仍然無色澄清透明。

3.2 形態(tài)觀察 采用透射電鏡(Transmission electron microscopy,TEM)JEM-1200EX觀察聚合物膠束的表面形態(tài)。試驗(yàn)采用磷鎢酸負(fù)染色法制備樣品。樣品制備方法如下：取自制的膠束溶液適量滴加至覆有碳包衣的400目銅篩網(wǎng)上，加1%磷鎢酸負(fù)染，在100 kV加速電壓下，在透射電鏡下觀察形態(tài)。見圖1。由圖1可見，自制mPEG45-b-PCL25-nifedipine膠束為外觀圓整的球形，粒徑<50 nm。

3.3 聚合物膠束粒徑 圖2為mPEG45-b-PCL25-nifedipine 與mPEG114-b-PCL61-nifedipine聚合物膠束在Nicomp-380 粒度測定儀下測定的粒徑與粒度分布圖。圖中可見，mPEG45-b-PCL25-nifedipine聚合物膠束的粒徑在28.4 nm，mPEG114-b-PCL61-nifedipine聚合物膠束的粒徑在34.8 nm，兩者都有較窄的粒度分布。載藥后聚合物膠束的粒徑變化不大，該粒徑測定結(jié)果和透射電鏡的測定結(jié)果一致。

圖1 mPEG45-b-PCL25-nifedipine聚合物膠束(a)、mPEG114-b-PCL61-nifedipine聚合物膠束(b)電鏡形態(tài)

3.4 聚合物膠束的體外釋放特性 聚合物膠束作為新型納米級藥物載體具有十分顯著的優(yōu)越性，能顯著提高難溶性藥物的溶解度，而聚合物膠束的釋藥行為，是評價(jià)制劑安全性的一項(xiàng)重要指標(biāo)，藥物的釋放行為與制劑安全性、有效性密切相關(guān)，因此本研究考察了硝苯地平聚合物膠束的體外釋放行為。

3.4.1 聚合物膠束釋放的液相條件 ①色譜條件(前期試驗(yàn)所建立方法學(xué))色譜柱：Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(66∶34，V/V)；檢測波長：235 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。②釋放標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別精密量取硝苯地平標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，加甲醇逐步稀釋分別配置0.2、0.5、1、2、5、10 μg/mL的硝苯地平溶液，HPLC法測定主峰面積，以濃度(C)和峰面積回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=26.339 C+0.129 8,r=1(見表1)。③空白干擾試驗(yàn):精密吸取空白釋放介質(zhì)磷酸鹽緩沖液(PBS)20 μL，過濾后進(jìn)樣，檢測波長235 nm，考察有無干擾因素。見圖3。

圖2 mPEG45-b-PCL25-nifedipine聚合物膠束(a)、mPEG114-b-PCL61-nifedipine聚合物膠束(b)粒徑

表1 硝苯地平標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)數(shù)據(jù)

圖3 空白PBS色譜圖

在硝苯地平的保留時(shí)間7.1 min左右未檢測到色譜峰，說明釋放介質(zhì)中無干擾試驗(yàn)測定的因素存在。

3.4.2 釋放試驗(yàn)操作 采用透析袋法考察硝苯地平膠束釋放情況，即在一定操作條件下，將裝有載藥膠束的透析袋置于生理介質(zhì)中進(jìn)行透析，定時(shí)取樣測定釋放介質(zhì)中的藥物濃度。透析袋的孔徑可截留聚合物膠束而允許游離藥物自由通過。

精密吸取1.5 mL的載藥膠束溶液置于透析袋中，并將透析袋放入50 mL的PBS緩沖液中，然后置于37 ℃的恒溫空氣浴振蕩器中，轉(zhuǎn)速150 rpm。每隔一定的時(shí)間，取0.3 mL透析袋外的釋放液，過濾后進(jìn)樣20 μL，并同時(shí)向釋放介質(zhì)中補(bǔ)充等量新鮮的PBS緩沖液以保持恒定的體積。

3.4.3 累計(jì)釋放量的計(jì)算 藥物的累計(jì)釋放量計(jì)算公式如下：

式中Er—— 硝苯地平累計(jì)釋放量，%;

Ve—— PBS的置換體積，0.3 mL;

V0—— 釋放介質(zhì)PBS的體積，50 mL；

Ci—— 第i次置換取樣時(shí)釋放液中藥的濃度，mg/L；

Cn—— 第n次置換取樣時(shí)釋放液中藥的濃度，mg/L；

mdrug—— 用于釋放的藥量，mg。

3.4.4 釋放情況考察 聚合物疏水性嵌段的化學(xué)組成、親水鏈段和疏水鏈段的比例與分子量、藥物的理化性質(zhì)、膠束粒徑大小和環(huán)境pH值等均會影響聚合物物膠束的藥物釋放。試驗(yàn)從聚合物的組成來探討藥物的釋放情況。

不同材料制備膠束的藥物釋放情況有所差別。試驗(yàn)選擇溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速100 rpm、時(shí)間24 h，考察自制的mPEG-b-PCL-nfidipine 聚合物膠束在pH=7.4、離子強(qiáng)度0.05 M的磷酸鹽緩沖液中的釋放情況。見表2。

表2 mPEG-b-PCL釋放情況(n=3)

結(jié)果顯示：mPEG45-b-PCL25在 4 h藥物累計(jì)釋放百分率為44.68%，12 h藥物累計(jì)釋放量達(dá)到72.62%，此后藥物釋放極為緩慢，24 h為74.43%，釋放不完全；mPEG114-b-PCL61在4 h藥物累計(jì)釋放百分率為71.00%，12 h藥物累計(jì)釋放量達(dá)到90.48%。釋放速率的先后順序mPEG114-b-PCL61> mPEG45-b-PCL25。

這2種材料的釋放情況說明：當(dāng)聚合物的種類一定時(shí)，疏水鏈越長，聚合物膠束藥物釋放越慢。這是由于藥物與疏水鏈段、親水鏈段的相互作用參數(shù)決定了藥物在膠束內(nèi)的位置，硝苯地平為疏水性藥物，大部分定位在膠束的內(nèi)核，所以疏水鏈段越長，內(nèi)核越大，藥物釋放越慢。此外，從試驗(yàn)結(jié)果中還可以看出，24 h內(nèi)mPEG114-b-PCL61比mPEG45-b-PCL25制備的膠束釋放速度較快，且較為完全。

4 討論

4.1 聚合物膠束常用的體外釋藥試驗(yàn)有2種，一種是本文采用的透析袋法，另一種是直接將聚合物膠束和生理介質(zhì)孵化,然后通過凝膠滲透色譜法分離游離藥物和包封藥物[5-9]。透析袋法由于操作簡單，更為常用。在試驗(yàn)過程中，采用MWCO=3 500的透析袋進(jìn)行透析，在保證藥物能自由進(jìn)出透析袋的同時(shí)，有效截留聚合物大分子。

4.2 37 ℃時(shí)硝苯地平在水和 0.05、0.1、0.2 M三種不同離子強(qiáng)度磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中的溶解度均為11.6 μg/mL，磷酸根離子的加入對藥物無增溶作用。為了滿足釋放漏槽條件，用添加5%SDS的方式來增大藥物的溶解度，但是試驗(yàn)考慮到加入表面活性劑后可能會影響膠束的結(jié)構(gòu)。為了更接近體內(nèi)生理環(huán)境，試驗(yàn)采用增大釋放介質(zhì)體積的方式來達(dá)到漏槽條件。

5 小結(jié)

5.1 本研究利用透射電鏡和Nicomp-380 粒度測定儀考察了膠束的外觀、粒度分布。結(jié)果表明此膠束為澄清透明的液體，粒徑20～60 nm,呈圓整球形，粒徑分布均勻。

5.2 本研究采用透析袋法考察了體外釋放。結(jié)果表明藥物釋放與聚合物的組成有關(guān)，當(dāng)聚合物的種類一定時(shí)，疏水鏈越長，聚合物膠束藥物釋放越慢。

參考文獻(xiàn)：

[1] 趙軍.兩親性核交聯(lián)聚合物膠束的制備與載藥應(yīng)用研究[D].天津：天津科技大學(xué),2009.

[2] 袁建軍,程時(shí)遠(yuǎn),封麟先.嵌段共聚物自組裝及其在納米材料制備中的應(yīng)用[J].高分子通報(bào),2002，1：6-13.

[3] Bader H,Ringsdorf H,Schmidt B.Water soluble polymers in medicine [J].Die Angewandte Makromolekulare Chemie，1984，123(1):457-485.

[4] George MW，Jhon PM.Molecular self-assembly and nanochemistry:a chemical strategy for the synthesis of nanostruetures[J].Maeromoleeules，1992，254:1312-1318.

[5] Gaucher G,Dufresne MH,Sant VP,et al.Block copolymer micelles:preparation,characterization and application in drug delivery[J].Journal of Controlled Release,2005,109:169-188.

[6] Aguiar J,Carpena P,Molivar JA,et al.On the determination of the critical micelle concentration by the pyrene 1∶3 ratio method [J].Journal of Colloid an Interface Science,2003,258(1):116-122.

[7] Demina T,Grozdova I,Krylova O,et al.,Relationship between the structure of amphiphilic polymers and their ability to disturb lipid bilayers[J].Biochemistry,2005,44:4042-4054.

[8] Yu C,He B,Xiong MH,et al.The effect of hydrophilic and hydrophobic structure of amphiphilic polymeric micelles on their transport in epithelial MDCK cells.[J].Biomaterials,2013,34(26):6284-E298.

[9] Kaihara S,Fisher JP,Matsumura S.Chemo-enzymatic synthesis of degradable PTMC-b-PECA-b-PTMC triblock copolymers and their micelle formation for pH-dependent controlled release.[J].Macromol Biosci,2009,9(6):613-621.