馬嵩，彭福，張?zhí)旆澹惪?/p>

（1. 濟(jì)南市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，山東濟(jì)南 250021；2. 濟(jì)南市淡水養(yǎng)殖科學(xué)研究所，山東濟(jì)南 250000；3. 蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123）

序言

有害赤潮肆虐于我國(guó)和世界各國(guó)沿海，是國(guó)際社會(huì)共同關(guān)注的重大海洋環(huán)境問(wèn)題和生態(tài)災(zāi)害。1998年至今，每年都發(fā)生了面積超過(guò)1000km的特大赤潮，其中有幾年赤潮面積甚至達(dá)到上萬(wàn)平方公里；與此同時(shí)，有毒、有害的赤潮原因種也在不斷增加，其中甲藻等有害種類已成為我國(guó)赤潮的主要原因種[1]。這些趨勢(shì)充分表明了我國(guó)赤潮問(wèn)題的嚴(yán)重性和復(fù)雜性。有些有害赤潮生物能產(chǎn)生毒素，經(jīng)貝類或魚類累積后危害食用者的健康和生命[2]，調(diào)查表明麻痹性貝毒和腹瀉性貝毒這兩類主要的藻毒素污染普遍存在于我國(guó)沿海，近年有記錄的貝毒事件中，有幾百人中毒，數(shù)十人死亡[3]?？梢哉f(shuō)水域生態(tài)中貝毒素問(wèn)題已經(jīng)是個(gè)值得引起高度重視的環(huán)境問(wèn)題。

由毒藻產(chǎn)生的毒素往往經(jīng)貝類、魚類等傳播媒介造成人類中毒，因而這類毒素通常被稱為貝毒、魚毒，而不是赤潮毒素或藻類毒素。貝類毒素主要分為5類：腹瀉性貝毒DSP、麻痹性貝毒PSP、神經(jīng)性貝毒NSP、記憶缺損性貝毒ASP、西加魚類毒素CTX等。

1 腹瀉性貝毒DSP

腹瀉性貝毒DSP是首先從紫貽貝的肝胰腺中分離出來(lái)的一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物活性物質(zhì)，一般在食用后會(huì)產(chǎn)生以腹瀉為主要特征。

在中國(guó)引發(fā)腹瀉性貝毒的藻類有：漸尖鰭藻Dinophy sisacuminata、具尾鰭藻D.cuta、倒卵形鰭藻D.fortii、底層原甲藻Prorocentrum lima、D.mitra、D.novegica、和D.tropos等[4]。

腹瀉性貝毒是一種脂溶性物質(zhì)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是聚醚或大環(huán)內(nèi)酯化合物[5]。目前發(fā)現(xiàn)的腹瀉性貝毒至少有12種，其中9種結(jié)構(gòu)已經(jīng)確定，分為3大類：大田軟海綿酸OA，及其衍生物鰭藻毒素DTX-3；大環(huán)內(nèi)酯貝毒素PTX-1、PTX-2、PTX-3、PTX-6；磺化毒物、紫夷貝毒素YTX及其衍生物。腹瀉性貝毒主要作用于酶系統(tǒng)，為腫瘤促進(jìn)劑，人食用后可引起多種不適反應(yīng)，包括腹瀉、惡心、嘔吐等，目前尚無(wú)有效的治療藥物。腹瀉性貝毒對(duì)人的最小中毒量為12-18MU。1MU相當(dāng)于3.2μgDTX-1、DSP的毒性LD50為192μg/kg。三類腹瀉性貝毒的毒理作用各有不同，大田軟海綿酸（OA）對(duì)小鼠的腹腔注射的LD50為116×10-8g/g，會(huì)使小白鼠或其它動(dòng)物腹瀉，現(xiàn)已證明其是一種重要的癌癥促進(jìn)劑。鰭藻毒素-3只會(huì)引起腹瀉，小白鼠LD50為5×10-8g/g。第二類大環(huán)內(nèi)酯-扇貝毒素對(duì)小白鼠LD50為116×10-7-717×10-7g/g，作用是損傷肝。而磺化毒素及其衍生物的作用部位是心肌，對(duì)小白鼠的LD50為1×10-7g/g[6]。

因?yàn)镈SP是一種潛在的毒物，在貝類中含量很少，因此測(cè)定方法需要十分靈敏可靠。在大多數(shù)貝樣中OA是DSP的主要成分，所以檢測(cè)方法也主要集中在OA上。主要方法有：

1.1 小白鼠分析法

小白鼠分析法屬于國(guó)際上通用的常用檢測(cè)方法。國(guó)內(nèi)常規(guī)的檢測(cè)也都用此方法[7]。該法由Yasumoto[6]等建立，具體方法是用丙酮提取樣品中的毒素到乙醚中，減壓縮蒸干后以1%的吐溫-60生理鹽水溶解殘留物，腹腔注射小白鼠，觀察其存活狀況，計(jì)算毒性。此法方便快捷，故商檢系統(tǒng)常使用此方法進(jìn)行檢測(cè)。計(jì)量單位是鼠單位（MU），鼠單位是由美國(guó)公職分析化學(xué)家協(xié)會(huì)AOAC定義[8]，一個(gè)鼠單位MU(相當(dāng)于0.18μg)為給予20g小白鼠注射1ml貝類提取物使其在15min內(nèi)致死的最小劑量。該方法在概括樣品毒性方面相當(dāng)有效，但也有較多的限制，如該法不能確定樣品中毒素結(jié)構(gòu)；毒素分子與受體親和的錯(cuò)誤率高±20%；該法是利用對(duì)小白鼠腹腔注射毒物測(cè)定其死亡時(shí)間以確定毒性大小，因此靈敏度低；該法在標(biāo)準(zhǔn)程序中不同小鼠的品系、批次、損傷程度和大小對(duì)毒素的靈敏度有很大的波動(dòng)性；浪費(fèi)較多的毒素和需使用活體動(dòng)物等等。

1.2 免疫法

免疫法是利用抗原-抗體反應(yīng)確定毒素類型及含量，包括ELISA、RIA、EIA及S-PIA法等。其中ELISA法中所采用的抗體僅與DTX21和OA反應(yīng)，不與其他毒物反應(yīng)，因此專一性較強(qiáng)，而且靈敏度可達(dá)10-9。用于毒素檢測(cè)的免疫法為生物體外測(cè)試法，其敏感性要比相應(yīng)的小白鼠生物法或HPLC法高得多，檢測(cè)級(jí)可以達(dá)到pg級(jí)。

1.3 細(xì)胞毒性分析

1）測(cè)定鼠肝細(xì)胞經(jīng)貝毒萃取物處理后的乳酸脫氫酶滲漏狀況，該法尚不成熟，需進(jìn)一步研究后方可用于毒性檢測(cè)。

2）L1210鼠白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制法：用血清培養(yǎng)L1210鼠白血病細(xì)胞，加入毒物萃取物，測(cè)定其細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制的情況，即可判斷其毒性大小[9]。

1.4 毛細(xì)管電泳法

N.Bouaichan[10]首先用毛細(xì)管膠束電動(dòng)電泳，紫外檢測(cè)器檢測(cè)貽貝中的OA與DTX22，但由于緩沖液等問(wèn)題，效果不是十分理想。在此基礎(chǔ)上，張基木[11]等用毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜MEKC檢測(cè)OA和DTX1，其檢測(cè)限達(dá)到3.25μg/ml。由于電泳具有操作簡(jiǎn)單、快速等特點(diǎn)，有望成為貝毒檢測(cè)的常規(guī)手段。

此外，還可以通過(guò)氣相液相色譜[12]及液質(zhì)聯(lián)用法[13]等化學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)，在后面毒素檢測(cè)中會(huì)有詳細(xì)化學(xué)方法的介紹。關(guān)于腹瀉性貝毒來(lái)說(shuō)，現(xiàn)有的檢測(cè)方法還各自存在不足。對(duì)于常規(guī)檢測(cè)來(lái)說(shuō)，免疫法是一種常規(guī)宜用方法，當(dāng)條件具備時(shí)，可以將毛細(xì)管電泳法作為貝毒檢測(cè)的常規(guī)手段。國(guó)外很多檢測(cè)部門都已經(jīng)開始使用此方法進(jìn)行檢測(cè)[14]，這將是腹瀉性貝毒的檢測(cè)的發(fā)展方向。

2 麻痹性貝毒PSP

麻痹性貝毒PSP是目前世界上分布最廣事故發(fā)生頻率最高的一種貝毒。PSP主要產(chǎn)自海洋中的單細(xì)胞甲藻，目前已經(jīng)分離出20種毒素，依基因的相似性分為3類，石房蛤毒素STX、新石房蛤毒素neo-STX、膝溝藻毒素GTX。它們是以石房蛤毒素STX為骨架和取代基不同而衍生出的多種化合物組成[15]。由于多疊六元環(huán)基本結(jié)構(gòu)衍生出的個(gè)別位置上基團(tuán)的差別，其毒性也略有差別[16]。

PSP可以沿食物網(wǎng)進(jìn)行傳遞、積累和代謝，結(jié)果不僅使直接營(yíng)濾食生活的貝類、草食性魚類等含毒，而且使許多更高營(yíng)養(yǎng)級(jí)的生物染毒。人們發(fā)現(xiàn)有毒藻被雙殼類如貽貝、蛤、牡蜘等濾食后，在胃、腸道內(nèi)經(jīng)消化吸收，其所蓄積的毒素成分可借由食物鏈傳遞至更高級(jí)的魚、甲殼類（蝦、蟹），甚至是哺乳類的體中[4]。近年來(lái)的野外及實(shí)驗(yàn)室研究還發(fā)現(xiàn)PSP可沿著浮游動(dòng)物（撓足類、枝角類）轉(zhuǎn)移至魚苗中[5]，從而對(duì)魚類的繁殖環(huán)節(jié)產(chǎn)生負(fù)面作用。仔細(xì)看來(lái)，海洋生態(tài)系統(tǒng)的各個(gè)營(yíng)養(yǎng)級(jí)似乎都可見PSP毒素存在的影子。

麻痹性貝毒的毒理作用是神經(jīng)肌肉麻痹劑，阻斷細(xì)胞納離子通道，造成神經(jīng)系統(tǒng)傳輸障礙而生產(chǎn)麻痹作用。對(duì)人的中毒量為600～5000MU，致死量為300～3000MU，且目前沒(méi)有對(duì)癥解毒劑。PSP的LD50在3～10×10-9之間，其中石房蛤毒素是眼鏡蛇毒素毒性的80倍，0.5mg足以使人致死。貝類攝入此毒素對(duì)本身無(wú)害，因毒素在貝類體內(nèi)呈結(jié)合狀態(tài)。當(dāng)人食入后，毒素會(huì)迅速釋放并呈現(xiàn)毒性作用，潛伏期僅數(shù)分鐘或數(shù)小時(shí)，癥狀包括四肢肌肉麻痹、頭痛惡心、流涎發(fā)燒、皮疹等，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致呼吸停止。

國(guó)內(nèi)的麻痹性貝毒產(chǎn)生的原因種多為有毒甲藻塔瑪亞歷山大藻（Alexandrium tamarense），所以研究的重點(diǎn)也在此藻種對(duì)海洋生物的相關(guān)影響方面。已知的有對(duì)黑褐新糠蝦（Neomysis awatschensis）的存活、生殖、生長(zhǎng)等有不利影響，影響程度隨藻細(xì)胞密度的增加而增加。在96h急性毒性實(shí)驗(yàn)中，塔瑪亞歷山大藻對(duì)黑褐新糠蝦的半致死密度為7000個(gè)/mL，去藻過(guò)濾液中糠蝦的死亡率為25%。在62d的慢性毒性實(shí)驗(yàn)中，藻密度900個(gè)/mL條件下對(duì)黑褐新糠蝦的繁殖產(chǎn)生嚴(yán)重影響[17]。顏天等[18]證實(shí)塔瑪亞歷山大藻對(duì)鱸魚（Lateolabrax japonicus）幼魚（2.5cm）的存活有明顯的影響，96h的半致死濃度為4000個(gè)/mL。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為毒素對(duì)貝類本身沒(méi)有影響，貝類只是起中間媒介的作用。但80年代以后的研究表明，有毒藻能夠影響貝類，影響的大小與貝的種類以及以往是否接觸過(guò)有毒藻有關(guān)[19]。傅萌等發(fā)現(xiàn)塔瑪亞歷山大藻能抑制墨西哥灣扇貝早期D形幼蟲的游泳能力，對(duì)D形幼蟲的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，使長(zhǎng)成的稚貝個(gè)體較小，而且它還能抑制仔貝的爬升附著能力。在對(duì)櫛孔扇貝受精卵孵化影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，塔瑪亞歷山大藻能顯著抑制櫛孔扇貝受精卵的孵化。同時(shí)，對(duì)雙殼類的受精卵和眼點(diǎn)幼蟲等發(fā)育段也有影響[20]。周立紅等研究了水中不同細(xì)胞密度塔瑪亞歷山大藻對(duì)菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）、翡翠貽（Perna viridis Linnaeus）鰓組織的Na，K-ATP酶活性的影響，結(jié)果顯示低密度藻細(xì)胞對(duì)這些動(dòng)物鰓組織Na，K-ATP酶有激活作用，高密度則有抑制作用[21]。

鑒于PSP的毒力特點(diǎn)，在其監(jiān)測(cè)方面，主要有下列方法：

2.1 高效液相色譜法（HPLC）方法

高效液相色譜法能對(duì)PSP的成分及毒力進(jìn)行準(zhǔn)確的分析和測(cè)定，主要有過(guò)柱氧化法[22]和柱前氧化法[23]，柱前氧化和過(guò)柱氧化的差別不僅是衍生化前后的分離對(duì)象不同，而且氧化手段也不同，柱后氧化比柱前氧化更有前途。此方法無(wú)論是譜圖、靈敏度還是回收率都比較可取，但是標(biāo)準(zhǔn)樣品的缺乏卻妨礙這個(gè)方法的推廣。而且柱后氧化法專一性強(qiáng)，要求設(shè)備較復(fù)雜，國(guó)內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室不能做到，且分析時(shí)間較長(zhǎng)。柱前氧化法只能檢測(cè)出貝體內(nèi)的幾種主要PSP毒素成分，普通的高效液相色譜儀就能完成。所以可以推廣柱前氧化法作為作為生物法檢測(cè)麻痹性毒素陽(yáng)性樣品的復(fù)檢方法。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的檢測(cè)方法目前已經(jīng)由國(guó)內(nèi)機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)研究，取得良好效果，可以作為未來(lái)高效液相色譜檢測(cè)發(fā)展方向[24]。

2.2 小鼠生物測(cè)定法

MBA作為PSP的半定性分析方法，被美國(guó)公職分析化學(xué)家協(xié)會(huì)AOAC推廣為PSP的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，同時(shí)也是唯一國(guó)際大多數(shù)國(guó)家普遍接受的統(tǒng)一方法。AOAC定義一個(gè)鼠單位MU（相當(dāng)于0.18μg）為給予20g小白鼠注射1ml貝類提取物使其在15min內(nèi)致死的最小劑量。該方法靈敏度低，其檢出限約160ngSTX/m1貝肉；所以無(wú)法進(jìn)行低毒量檢驗(yàn)。

2.3 電泳技術(shù)

在PSP家族中，各種毒素分子所帶電荷量不同，如STX、neoSTX、dc-neoSTX、d-STX等均帶兩個(gè)正電荷；GTX1～6、dc-GTX1～4、do-GTX2/3等均帶一個(gè)正電荷；而C1～4都不帶電荷。所帶電荷量的差異可用電泳技術(shù)初步分離PSP，在醋酸纖維薄膜上涂氧化劑（如H2O2等）加熱氧化。使毒素分子發(fā)生顏色反應(yīng)，在紫外燈下檢測(cè)。在多種電泳技術(shù)中，最常用的是毛細(xì)管電泳（Capillaryelec trophoresis, CE），主要用于分離測(cè)定PSP毒素中的非衍生毒素，如STX，neoSTX等，電泳峰常通過(guò)一個(gè)離子噴霧CE-MS接口用質(zhì)譜儀檢測(cè)。而串聯(lián)的質(zhì)譜分析技術(shù)可提供毒素分子的結(jié)構(gòu)信息，以鑒定各異構(gòu)復(fù)合物[25]。

2.4 免疫檢測(cè)

根據(jù)抗原抗體反應(yīng)，采用針對(duì)麻痹性貝毒毒素的抗體檢測(cè)毒素，現(xiàn)在已經(jīng)建立了放射免疫檢測(cè)和酶聯(lián)免疫檢測(cè)等多種技術(shù)。免疫檢測(cè)法具有方便、迅速的特點(diǎn)，缺點(diǎn)是價(jià)格高，且各毒素之間的交叉反應(yīng)低，不能完全體現(xiàn)出樣品的毒性。

2.5 細(xì)胞毒性測(cè)試檢測(cè)方法

PSP毒素具有鈉離子通道阻塞劑的特性。加拿大學(xué)者應(yīng)用結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色的辦法，減少了細(xì)胞用量，可以同時(shí)大量檢測(cè)樣品，靈敏度高，但缺點(diǎn)是操作繁瑣。陳杰等對(duì)這些方法進(jìn)行了改進(jìn)，步驟簡(jiǎn)便，并且實(shí)驗(yàn)證明此拮抗或解救作用與PSP類毒素呈劑量反應(yīng)關(guān)系[26]。

由于麻痹性貝毒和河豚毒在致毒機(jī)理上有很多相似之處，可以和河豚毒進(jìn)行交互合并性檢測(cè)。

3 神經(jīng)性貝毒NSP

神經(jīng)性貝毒NSP主要是從天然和培養(yǎng)的有毒赤潮生物——短裸甲藻（Crymnodinium breve）細(xì)胞提取液中分離出神經(jīng)性貝毒毒素成分。因貝類攝食短裸甲藻后在體內(nèi)蓄積，被人類食用后產(chǎn)生以神經(jīng)麻痹為主要特征的中毒。從短裸甲藻細(xì)胞提取液中分別分離出神經(jīng)性貝毒共計(jì)13種，其中11種成分結(jié)構(gòu)已經(jīng)確定。

NSP主要通過(guò)兩種途徑對(duì)人體造成危害。一種途徑是由食用受短裸甲藻赤潮污染的貝類或含有短裸甲藻分泌毒素的貝類引起的人體神經(jīng)性中毒。神經(jīng)性中毒癥狀有：眩暈、頭部神經(jīng)機(jī)能失調(diào)、瞳孔放大、身體冷熱無(wú)常、惡心、嘔吐、腹瀉；嚴(yán)重情況下，心律失常、感覺(jué)急性窒息。其中毒的潛伏期在30min～3h之間。中毒癥狀的持續(xù)時(shí)間，依據(jù)食用有毒貝類量的多少有所差異。通常在3～4d之間。據(jù)McFarren[27]報(bào)道，50～80MU的神經(jīng)性貝毒毒素將使人體出現(xiàn)某些中毒癥狀；400～500MU的神經(jīng)性貝毒將使人體出現(xiàn)中等程度的中毒癥狀。

另一種途徑是與呼吸或接觸了含有短裸甲藻細(xì)胞或其代謝物的海洋氣溶膠顆粒有關(guān)的呼吸道中毒癥狀。主要中毒癥狀有氣喘、干咳、流清鼻涕和刺激性結(jié)膜炎。其中毒癥狀可以持續(xù)數(shù)日。

NSP可以引起魚類的大量死亡，但NSP的毒性總的來(lái)說(shuō)較低，對(duì)小鼠的LD50為50g/kg。主要的檢測(cè)方法有：

3.1 免疫法

Dr.Poli用RIA放射免疫分析法分析貝類提取液和NSP感染的病人尿液，發(fā)現(xiàn)4個(gè)主峰，其中一個(gè)峰經(jīng)HPLC-MS鑒定是PbTX23，而另三個(gè)分析不出來(lái)的峰則是含量更高的NSP，Garth-waite[28]提出了一套針對(duì)NSP毒素的ELISA檢測(cè)法，對(duì)于PbTX-3有檢測(cè)限為0.53ng/ml，其優(yōu)勢(shì)是可以直接分析海水，而且有潛力作為鑒別有毒鞭毛藻的工具。Maucher[29]等1422采取EL1SA和最優(yōu)血液收集卡法檢測(cè)瓶鼻海豚沾染短裸甲藻毒素PbTx-3，用于監(jiān)測(cè)赤潮發(fā)生時(shí)的短裸甲藻毒素存在情況。

3.2 液質(zhì)聯(lián)用LC-MS法

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)幾乎可以分析所有的貝毒液質(zhì)聯(lián)用依賴于高效液相色譜把貝毒成份通過(guò)界面裝置帶到質(zhì)譜中。有兩種界面技術(shù)可用，一種是電噴霧電離ESI，另一種是大氣壓化學(xué)電離AP-CI，這兩種技術(shù)都已經(jīng)應(yīng)用于貝毒分析。Hua YS[30]等用LC-MS（ESI）法，其檢測(cè)限達(dá)到10pg。

3.3 高效液相色譜/四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（HPLC/Q-TOFMS）

目前上海出入境檢疫局利用高效液相色譜/四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（HPLC/Q-TOFMS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)貝類樣品中的PbTX22進(jìn)行了檢測(cè)[31]，由于Q-TOFMS具有高靈敏度、高選擇性的特點(diǎn)，可以在極低的濃度下作全譜掃描，提供精確質(zhì)量，因此可以對(duì)微量神經(jīng)性貝毒PbTX22進(jìn)行快速鑒別和測(cè)定，檢測(cè)限達(dá)到0.5ng，回收率及精密度結(jié)果都令人滿意。只是設(shè)備要求太高，不宜推廣。

4 記憶缺損性貝毒ASP

赤潮毒素記憶缺損性貝毒ASP是由多列擬菱形藻p.seudonitzsehia分泌產(chǎn)生的毒素，直到1987年才被發(fā)現(xiàn)，其引起中毒的成份是軟骨藻酸DA[32]，軟骨藻酸最早是在日本鹿兒島的大型藻類植物軟骨藻（Chondria armata domoi）中分離出來(lái)的，并作為胃腸道的驅(qū)蟲藥使用[33,34]它是一種強(qiáng)烈的神經(jīng)毒性非蛋白氨基酸，有七種異構(gòu)體，由長(zhǎng)鏈羽狀硅藻代謝產(chǎn)生的一種物質(zhì)，能導(dǎo)致短期記憶功能長(zhǎng)久損害。

Lage等[35]的最新研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄牙沿海的多列擬菱形藻生長(zhǎng)期，在章魚的食物（貝類）中未檢測(cè)到軟骨藻酸，而章魚的消化腺中卻檢測(cè)到了軟骨藻酸，可見軟骨藻酸能通過(guò)貝類等的富集進(jìn)入海洋生物的食物鏈中。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，軟骨藻酸攝入量為15～20mg的人群未受其影響，攝入量為295mg時(shí)表現(xiàn)出各種嚴(yán)重癥狀，攝入量為60～110mg時(shí)會(huì)引起中度胃腸道癥狀，可見軟骨藻酸的毒性具有劑量效應(yīng)[34]。半致死量LD為10μg/50kg。在我國(guó)對(duì)ASP貝毒開始引起足夠的重視和關(guān)注。

目前，ASP的分析方法主要有生物小鼠法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法[36]以及一些免疫化學(xué)方法。生物小鼠法優(yōu)缺點(diǎn)前面已經(jīng)在前面敘述過(guò)。高效液相色譜（HPLC）-紫外檢測(cè)方法和HPLC-MS分析方法因其選擇性和靈敏度高而被普遍認(rèn)可。迄今為止，HPLC對(duì)貝毒素的分析應(yīng)用最成功的是對(duì)軟骨藻酸的分析。澳大利亞食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)將此法列為國(guó)標(biāo)。為保證分析回收率，在樣品處理時(shí)，應(yīng)盡可能減少酸性溶液在空氣中的暴露時(shí)間[37]。另外，還將液相色譜/四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜連用的測(cè)定法用于到ASP的測(cè)定，取得不錯(cuò)的效果[38]。但HPLC等儀器設(shè)備價(jià)格昂貴，樣品的前處理操作復(fù)雜故而不易滿足大批量樣品的檢測(cè)分析需要。近年來(lái)得到快速發(fā)展的ELISA方法[39,40]，以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)迅速和分析成本低的優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于環(huán)境中污染物的分析。隨著科技的發(fā)展，現(xiàn)有的多克隆抗體逐漸被特異性更好的單克隆抗體取代，單克隆抗體在ELISA方法的應(yīng)用大大地提高了ELISA方法的特異性和靈敏度。Kawatsu等首次采用單克隆抗體制備技術(shù)，建立檢測(cè)DA的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，檢測(cè)限低至0.15～10.00ng/ml[41]。國(guó)內(nèi)方面，高利利等利用雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)成功制備了能穩(wěn)定分泌抗軟骨藻酸單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并通過(guò)體內(nèi)誘生腹水并純化后，得到效價(jià)為1∶64000的單克隆抗體，為進(jìn)一步開發(fā)軟骨藻酸快速檢測(cè)ELISA試劑盒奠定基礎(chǔ)[42]。

5 西加魚毒素 CTX

西加魚毒素CTX是深海藻類分泌的毒素，被熱帶或亞熱帶食草性魚類蓄積并在魚體內(nèi)被氧化成的一類強(qiáng)毒性毒素[43]。主要的產(chǎn)毒藻是有毒崗比亞藻（Gambierdiscus toxicus），可分為脂溶性的西加毒素（Ciguatoxins, CTX）和黑兒茶（Gambiero1），水溶性的刺尾魚毒素（Maitotoxin,MTX）和水媳毒素（Palytoxin）兩大類[44]。其中主要致毒成分是西加魚毒素CTX和刺尾魚毒素MTX。西加魚毒素是熱穩(wěn)定物質(zhì)，中毒后能引起一系列胃腸道和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，能夠作用于鈉離子通道位點(diǎn)并導(dǎo)致靜息狀態(tài)下鈉離子通道打開，造成鈉離子內(nèi)流，與神經(jīng)性貝毒的作用機(jī)制相似。而對(duì)神經(jīng)性貝毒建立起來(lái)的免疫試劑能和西加魚毒發(fā)生交叉反應(yīng)，表明兩種毒素之間存在相似的表位。主要毒性表現(xiàn)是神經(jīng)功能失調(diào)，最著名的特征是“干冰的感覺(jué)”的熱感顛倒。即當(dāng)觸摸熱的東西會(huì)感覺(jué)涼，把手放入水中會(huì)有觸電或摸干冰的感覺(jué)。CTX死亡率較低，但每年中毒者卻高達(dá)數(shù)萬(wàn)人。CTX的LD50為0.45μg/kg；MTX是水溶性毒素，LD50為0.17μg/kg。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表面，CTX毒性是河豚毒TTX的100倍，是至今發(fā)現(xiàn)的分子量最大、毒性最強(qiáng)的自然產(chǎn)物。

檢測(cè)西加魚毒素可采用小鼠生物法、免疫法和HPLC法。其中免疫法由于西加魚毒素的抗體和其他聚醚類物質(zhì)的交叉反應(yīng)以及抗體供應(yīng)原因限制了其方法的廣泛應(yīng)用。HPLC方法是利用分子結(jié)構(gòu)上的羥基與蒽羰化青反應(yīng)生成熒光性物質(zhì)，然后在FLD下檢測(cè)，其檢測(cè)限可達(dá)ng/kg級(jí)，線性較好。

總結(jié)

水域生態(tài)中的海洋毒素已經(jīng)成為世界上海洋環(huán)境生態(tài)的研究熱點(diǎn)，現(xiàn)在主要的檢測(cè)方法主要是動(dòng)物活體檢測(cè)，免疫法以及高效液相色譜等檢測(cè)方法。這些方法各自有其不足之處，都有待完善。隨著科研的進(jìn)一步深入，新的毒素不斷被發(fā)現(xiàn)，毒素標(biāo)準(zhǔn)的獲取也成為一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。我們需要更加深入研究，了解其完整的制毒原理，以達(dá)到對(duì)其控制并不斷提高檢測(cè)分析方法。使之更簡(jiǎn)便、更快速、更靈敏的進(jìn)行貝毒檢測(cè)，對(duì)其潛在的危害做出判斷保障人類健康。并充分利用海洋毒素這種自然的產(chǎn)物造福人類。

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