胡毓安，史利寧，李芳秋，李 偉，馬春芳，年 娜

0 引 言

侵襲性念珠菌病(invasive candidiasis，IC)在免疫抑制患者及ICU患者中的發(fā)病率逐年升高，盡管臨床醫(yī)師對IC的診治越來越重視，但其致死率仍可高達(dá)40%～55%［1－2］，其中白色念珠菌仍是最常見的致病菌，約占50%［3－5］。血培養(yǎng)是目前IC診斷的實驗室金標(biāo)準(zhǔn)和傳統(tǒng)的檢測方法，由于敏感性低(約50%)、結(jié)果回報時間長，往往延誤了IC的診斷和治療，是造成IC高病死率的部分原因。尋找可靠有效的IC診斷抗原標(biāo)志物，并建立定量檢測方法，可以彌補(bǔ)血培養(yǎng)的不足，提高IC的實驗室診斷水平并用于療效監(jiān)測。烯醇化酶(enolase，Eno)存在于念珠菌細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，由440個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量在45000～48000。Eno在白色念珠菌中是含量最豐富的可溶性蛋白、重要的菌絲相蛋白［6－7］和免疫優(yōu)勢抗原［8－13］，在念珠菌能量代謝中起重要作用［14－15］，是一個潛在的 IC診斷標(biāo)志物。本研究建立了定量檢測白色念珠菌Eno的免疫磁珠方法，并應(yīng)用于念珠菌培養(yǎng)上清檢測，為深入了解Eno對IC的診斷價值奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及來源 本研究所用白色念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新型隱球菌和釀酒酵母均為本科微生物室臨床分離菌株，經(jīng)科瑪嘉顯色培養(yǎng)基和VITEK2-compact全自動細(xì)菌鑒定儀(法國梅里埃公司)鑒定。

1.2 主要試劑及儀器 氨基化磁性微珠(Merck公司)由南方醫(yī)科大學(xué)吳英松教授惠贈。N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、4-嗎啉乙磺酸(MES)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)購自Sigma公司。白色念珠菌Eno重組蛋白、抗Eno單克隆抗體及羊抗Eno多克隆抗體為本室制備及純化［16］;HRP購自上海國源生物技術(shù)有限公司;RPMI 1640為Gibco公司產(chǎn)品，小牛血清購自浙江杭州四季青生物工程材料有限公司，BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo公司，其他試劑均為分析純。12孔磁分離架和96孔板磁分離架購自天津市倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心。Model 680型酶聯(lián)儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品，QB-128型旋轉(zhuǎn)混勻器購于江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司。75-2A微量振蕩器購于上海醫(yī)用分析儀器廠。

1.3 免疫磁珠制備 參照文獻(xiàn)［17－18］，取100 μL(100 mg/mL)磁珠懸液，加入1 mL結(jié)合緩沖液(0.1 mol/L MES，pH5.0);渦旋混勻后將離心管置于12孔磁分離架上60 s，吸去上清，重復(fù)上述操作1次。加入1 mL結(jié)合緩沖液，混懸磁珠，依次加入40 μL EDC 和 25 μL NHS(現(xiàn)用現(xiàn)配，濃度均為10 mg/mL)，室溫旋轉(zhuǎn)混勻30 min，置于12孔磁分離架上60 s，吸去上清。加入1 mL結(jié)合緩沖液稀釋的Eno單克隆抗體(500 μg)，4℃旋轉(zhuǎn)(30 r/min)混勻過夜，于12孔磁分離架上分離結(jié)合Eno單克隆抗體的免疫磁珠60 s，吸取全部上清;加入1 mL TBST(25mmol/L Tris-HCl，0.15 mol/L NaCl，0.05%Tween，pH7.2)混懸、洗滌免疫磁珠1次，置于磁性分離架上60s，棄去上清后加入 0.01 mol/L PBST(含0.05%Tween20的 PBS，pH7.2)將免疫磁珠稀釋至 500 μg/mL，4℃保存。

1.4 培養(yǎng)上清制備 參照文獻(xiàn)［19］進(jìn)行。

1.5 HRP標(biāo)記的羊抗Eno制備 按改良過碘酸鈉法標(biāo)記。

1.6 免疫磁珠法檢測Eno 在96孔空白酶聯(lián)反應(yīng)板中每孔加入免疫磁珠和100 μL待檢標(biāo)本室溫振蕩混勻;將反應(yīng)板置于96孔板磁分離架上30 s，吸棄上清，加入100μL PBST振蕩洗滌1min，磁性分離30 s，吸棄上清;重復(fù)洗滌5次。加入HRP-羊抗Eno 100 μL，室溫振蕩混勻;磁性分離、PBST洗滌5次;加入底物液 TMB-H2O2100 μL，室溫振蕩混勻10 min;加入 50 μL 0.5 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，于酶聯(lián)儀上用測試波長450 nm、參比波長630 nm讀取吸光度(A)值。

2 結(jié) 果

2.1 磁珠耦聯(lián)率測定 磁珠過夜耦聯(lián)抗原后，經(jīng)磁性分離的上清液蛋白質(zhì)定量為72.8 μg，耦聯(lián)率為85.44% 。

2.2 免疫磁珠法反應(yīng)條件優(yōu)化 方陣滴定法選定免疫磁珠反應(yīng)量為20μL，與重組Eno或待檢樣品結(jié)合時間為 45 min，與 HRP-羊抗 Eno結(jié)合時間為45 min，HRP-抗人 IgG 最適濃度為 1∶3000。

2.3 免疫磁珠法定量檢測Eno主要性能指標(biāo)

2.3.1 精密度 將Eno重組蛋白用0.01 mol/L PBS稀釋為25 ng/mL(高濃度)和5 ng/mL(低濃度)，同一批次檢測20份，計算批內(nèi)精密度;連續(xù)檢測20批次，計算批間精密度。Eno濃度為25 ng/mL和5 ng/mL時，批內(nèi)和批間精密度分別為 4.54%、5.87%和 5.26%、8.82%。

2.3.2 最低檢出下限 測定培養(yǎng)基質(zhì)(含20%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液)A值(±s)為0.011±0.004(n=20)，以0.023(x+3s)為cut-off值。將重組蛋白用培養(yǎng)基質(zhì)稀釋為 2.00、1.00、0.50、和 0.25 ng/mL，每個濃度重復(fù)檢測10次，分別計算不同濃度重組Eno蛋白A值的x和s。見表1。以重組Eno蛋白A值(x－2s)＞0.023(cut-off)為標(biāo)準(zhǔn)，最低檢出下限為0.5ng/mL。

表1 不同Eno濃度A值(n=10)Table1 Optical density of different levels of Eno(n=10)

2.3.3 線性范圍 將重組蛋白用培養(yǎng)基質(zhì)稀釋為50.0、25.0、10.0、5.0、2.5、1.0 和 0.5 ng/mL，培養(yǎng)基質(zhì)作為空白對照，用A值和濃度進(jìn)行回歸分析，相關(guān)系數(shù) R2=0.9923，線性范圍為 0.5～50 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 免疫磁珠法定量檢測Eno標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure1 Standard curve of IMB assay for Eno

2.3.4 阻斷試驗 將羊抗Eno加入50 ng/mL的抗原溶液，使羊抗 Eno終濃度分別為 1、2、4和 8 μg/mL，置37℃溫育1 h后，檢測混合液中Eno的A值?？梢婋S抗體濃度增加，測得的Eno A值不斷下降，見圖2。當(dāng)加入的羊抗Eno濃度為8 μg/mL時，阻斷率為95.46%。

圖2 免疫磁珠法檢測阻斷實驗Figure2 Block test of IMB assay for Eno

2.4 培養(yǎng)上清Eno檢測結(jié)果

2.4.1 不同溫度下白色念珠菌培養(yǎng)上清中Eno檢測結(jié)果 37℃培養(yǎng)4 h后，涂片可見白色念珠菌形成假菌絲，培養(yǎng) 24 h，上清中 Eno濃度為 3.89 ng/mL。由于1640完全培養(yǎng)基中含有20%小牛血清，因此25℃培養(yǎng)24 h后，涂片也可看見假菌絲的形成，但與同期的37℃培養(yǎng)物相比，假菌絲的比例較低，上清中Eno濃度為0.74 ng/mL。25℃培養(yǎng)48 h，上清中Eno濃度為3.05ng/mL，此時37℃培養(yǎng)上清中Eno濃度為7.77 ng/mL。不同培養(yǎng)溫度下Eno濃度均隨時間延長而增加。在整個觀察期間，25℃培養(yǎng)液中白色念珠菌菌絲的生長弱于37℃培養(yǎng)液，培養(yǎng)上清中Eno含量始終低于37℃培養(yǎng)上清。見圖3。

圖3 不同溫度下白色念珠菌培養(yǎng)上清Eno含量Figure3 Levels of Eno in the supernatant of Candida albican culture incubated in 37℃and 25℃

2.4.2 不同真菌培養(yǎng)上清中Eno檢測結(jié)果 涂片結(jié)果顯示，培養(yǎng)4h時白色念珠菌和熱帶念珠菌出現(xiàn)菌絲生長，培養(yǎng)48 h近平滑念珠菌出現(xiàn)明顯的菌絲生長。37℃培養(yǎng)24h后，白色念珠菌培養(yǎng)上清中可檢出Eno，濃度為3.89 ng/mL，隨培養(yǎng)時間延長上清中Eno逐漸增多，培養(yǎng)至 120 h，Eno濃度達(dá) 37.89 ng/mL。近平滑念珠菌37℃培養(yǎng)48h，上清可檢測出少量Eno(1.26 ng/mL)，但隨后一直保持低水平，培養(yǎng)至120h，Eno濃度為2.98ng/mL。在整個培養(yǎng)過程中，熱帶念珠菌、光滑念珠菌、季也蒙念珠菌和新型隱球菌、釀酒酵母培養(yǎng)上清內(nèi)未檢測出Eno。見圖4。

圖4 不同真菌培養(yǎng)上清Eno含量Figure4 Levels of Eno in the supernatant of fungi cultures

3 討 論

基于抗原診斷的非培養(yǎng)方法如1，3-β-D葡聚糖(1，3-β-glucan，BG)、甘露聚糖的檢測可為 IC 診斷提供直接依據(jù)，雖然敏感性適中，但彌補(bǔ)了血培養(yǎng)的不足，近年來在臨床得到了廣泛的應(yīng)用。歐洲癌癥-侵襲性真菌感染治療研究協(xié)作組和美國國立變態(tài)反應(yīng)和感染病研究院真菌病研究組(EORTC/MSG)將BG納入侵襲性真菌感染臨床診斷(probable)和擬診(possible)的微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)［20］。在BG檢測中有些容易造成假陽性的因素，如透析、輸注白蛋白注射液、靜脈導(dǎo)管置入、抗腫瘤藥物中的類似成分、手術(shù)紗布污染、某些細(xì)菌感染等，限制了BG在侵襲性念珠菌感染中的診斷作用［21－22］，研究者致力于尋找新的用于IC診斷抗原標(biāo)志物。

Walsh 等［22］和 Mitsutake 等［23－24］報道在 IC 患者外周血中會出現(xiàn)Eno抗原血癥，Eno檢測IC的敏感性和特異性為71.8%～75%和96%～100%。他們認(rèn)為Eno抗原檢測是對血培養(yǎng)方法的有益補(bǔ)充，如果和甘露聚糖、BG聯(lián)合檢測可以提高IC檢測的準(zhǔn)確性。Mitsutake等［24］用于檢測的多克隆抗體是采用白色念珠菌菌體純化Eno蛋白免疫家兔后獲得，不能區(qū)分不同念珠菌所致感染，檢測靈敏度為5ng/mL。Walsh等［23］使用的檢測模式和本研究類似，也采用了單抗和多抗的檢測組合，Eno的檢出下限為0.5～1ng/mL，但未對不同念珠菌感染的特異性進(jìn)行評價。

我們前期已成功建立雙抗體夾心ELISA定性檢測Eno［19］，證實所采用的單抗和多抗組合可以特異性識別白色念珠菌增殖過程中產(chǎn)生的天然抗原，除與近平滑念珠菌有微弱交叉反應(yīng)外，與其他念珠菌和新型隱球菌、釀酒酵母無交叉反應(yīng)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，Eno水平與白色念珠菌菌絲生長呈正相關(guān)，檢測Eno水平可以反映白色念珠菌侵襲性生長的發(fā)生，我們認(rèn)為實現(xiàn)Eno的定量檢測有助于評估IC的發(fā)生和監(jiān)測治療效果。

念珠菌抗原檢測受到在血清中清除快，循環(huán)血中含量低的局限，新免疫技術(shù)和平臺的出現(xiàn)，將為提高IC患者實驗室診斷水平創(chuàng)造條件。免疫磁珠分離技術(shù)是將免疫學(xué)反應(yīng)的高度特異性與磁珠特有的磁響應(yīng)性相結(jié)合的一種新興免疫學(xué)技術(shù)，具有分離快速、簡單和靈敏的優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于免疫細(xì)胞分離、病原微生物學(xué)和免疫學(xué)檢測［25］。本研究將白色念珠菌Eno單克隆抗體耦聯(lián)至磁性微球上，制備免疫磁珠，建立定量檢測Eno方法，其方法學(xué)性能指標(biāo)如精密度、特異性、線性范圍符合臨床實驗要求，最低檢測下限與文獻(xiàn)報道一致。免疫磁珠法對常見真菌培養(yǎng)上清中Eno含量和白色念珠菌不同培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)上清中Eno含量的定量檢測結(jié)果，支持了我們前期研究的定性結(jié)果。免疫磁珠法檢測的特異性與ELISA法一致，均可特異識別白色念珠菌Eno蛋白，與近平滑念珠菌有弱交叉反應(yīng)性，提示該法有望用于特異診斷白色念珠菌引發(fā)的侵襲性念珠菌感染，為臨床正確選擇抗真菌藥物提供依據(jù)。免疫磁珠具有較大的比表面積，其結(jié)合效率類似于液相-液相反應(yīng)，高于ELISA的固相-液相反應(yīng)。利用免疫磁珠的磁響應(yīng)性，抗原抗體結(jié)合物的分離更為快速簡便。與我們前期建立的雙抗體夾心ELISA定性檢測方法相比，免疫磁珠法實現(xiàn)了Eno的定量檢測，溫育時間縮短了30 min、孵育溫度從37℃簡化為室溫，最低檢測下限從1.25 ng/mL降低至0.5 ng/mL，此外還具有節(jié)約檢測試劑用量的優(yōu)點(diǎn)。

綜上所述，本研究成功建立定量檢測Eno的免疫磁珠法，對念珠菌培養(yǎng)上清中天然Eno抗原的檢測結(jié)果與前期研究相符。今后，我們將用該方法進(jìn)一步評估Eno在IC的早期診斷、療效監(jiān)測和預(yù)后預(yù)測中的價值。

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