耿海云，陳映霞，秦叔逵，楊愛珍，徐海軍，成 遠(yuǎn)，薛 松

0 引 言

胃癌位于惡性腫瘤死因第3位［1］，目前其臨床療效仍不理想［2］。腫瘤生長通過新生血管從宿主獲取營養(yǎng)成分，同時腫瘤細(xì)胞經(jīng)血管發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此抗血管生成治療成為胃癌分子靶向治療的研究熱點。重組人血管內(nèi)皮抑素(rh-Endostatin，rh-ES)(商品名恩度)是目前臨床上應(yīng)用較多的一種內(nèi)源性血管生成抑制劑，通過多種作用機制抑制腫瘤生長［3］。本研究通過觀察rh-ES聯(lián)合紫杉醇在體外對高度侵襲型胃癌細(xì)胞株生物學(xué)活性的影響，了解其可能的作用機制，為進一步的臨床研究和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人胃癌MGC803細(xì)胞株由我院中心實驗室保存。紫杉醇注射液購自百時美施貴寶投資有限公司，rh-ES注射液購自山東先聲麥得津生物制藥有限公司。Transwell小室購自Croning公司，Matrigel購自BD公司;纖維粘連蛋白溶液(fibronectin，F(xiàn)N)購自Sigma公司;血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、MMP-9單克隆抗體、β-actin抗體以及HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購自上海麥約爾生物技術(shù)有限公司。RIPA蛋白裂解液試劑盒購自碧云天公司，ECL反應(yīng)檢測試劑盒、蛋白濃度檢測試劑盒購自生興生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 MGC803細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2溫箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。根據(jù)實驗設(shè)計將上述培養(yǎng)細(xì)胞分為:①對照組:加入與實驗組等體積的RPMI 1640培養(yǎng)液;②紫杉醇組:加入濃度為0.0001 μg/mL 紫杉醇溶液;③rh-ES組:分別加 入 50 μg/mL rh-ES(rh-ES50 組)、100 μg/mL rh-ES(rh-ES100組)、200 μg/mL rh-ES(rh-ES200 組);④聯(lián)合組:加入 0.000 1 μg/mL 紫杉醇 +50 μg/mL rh-ES(聯(lián)合50組)、加入0.0001μg/mL紫杉醇+100 μg/mL rh-ES(聯(lián)合 100 組)、加入0.000 1 μg/mL 紫杉醇 +200 μg/mL rh-ES(聯(lián)合200組)。

1.2.2 MTT法測定細(xì)胞增殖情況 取對數(shù)生長期的MGC803細(xì)胞，胰酶消化后計數(shù)，以每孔3×104個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μL，每組6復(fù)孔。加藥后24、48、72 h每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入鹽酸異丙醇100 μL，微振蕩器振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在570 nm波長下測吸光度(A)值，各組取6孔平均值。計算細(xì)胞增殖抑制率:

抑制率=［1-(加藥組平均A值-空白孔A值)/(對照組平均A值-空白孔A值)］×100%

采用藥物相互作用指數(shù)(coefficient of drug interaction，CDI)反映rh-ES和紫杉醇兩藥相互作用性質(zhì)。CDI值計算如下:

CDI=AB/A×B

AB=聯(lián)合組A570/對照組A570

A、B=各單藥組A570/對照組A570

如CDI＜0.9，表示兩藥作用性質(zhì)為協(xié)同;CDI為0.9～1.1，兩藥性質(zhì)為相加;CDI＞1.1，則兩藥作用性質(zhì)為拮抗。

1.2.3 Transwell小室法測定細(xì)胞侵襲能力 將Transwell小室放入 24 孔板中，用 Matrigel 50 μL/孔均勻包被小室底部微孔濾膜的正面，10 mg/L的FN 50 μL均勻包被微孔濾膜的反面，每孔加入600 μL含30%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，收集對數(shù)生長期的MGC803細(xì)胞，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個/mL，每小室加入50 μL細(xì)胞懸液。細(xì)胞分組后小室依次加入50 μL含對應(yīng)藥物濃度培養(yǎng)液，每組3復(fù)孔。置37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，吸棄小室內(nèi)的培養(yǎng)液，用棉簽將膜上表面未遷移的細(xì)胞小心擦拭。下表面用10%甲醛固定30 min，蘇木精染色20 min。顯微鏡下觀察微孔濾膜外側(cè)面上的細(xì)胞，計數(shù)6個視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，計算均值。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期細(xì)胞加入蛋白裂解液，置于冰上裂解分離蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白濃度，調(diào)整各組上樣蛋白量至50μg。灌制10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠，加樣后恒流40 mA，直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部。濕電轉(zhuǎn)恒壓100 V 90 min，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST)封閉1h。封閉液按1∶4000和1∶1000的比例分別稀釋一抗和β-actin抗體，4℃孵育過夜。用含0.05%Tween20的 TBST搖床洗滌3次(10 min/次)后，加入 1∶1000 二抗室溫孵育 2 h，0.05%TBST溶液搖床洗膜3次(10 min/次)，ECL顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間各參數(shù)比較采用析因分析，多組間比較采用單因素方差分析。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同用藥方式對MGC803細(xì)胞增殖能力的影響 與對照組相比，各用藥組作用24、48、72 h后均能夠減弱MGC803細(xì)胞的增殖能力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。聯(lián)合組較紫杉醇組對細(xì)胞增殖抑制率明顯增強。聯(lián)合組中兩藥相互作用指數(shù)CDI值在0.91～1.01之間，說明兩藥對細(xì)胞的殺傷作用呈相加效應(yīng)(P＜0.05)。在聯(lián)合組和紫杉醇組中，細(xì)胞增殖抑制率具有劑量和時間依賴性，且各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。rh-ES組也觀察到劑量依賴性，劑量越高，增殖能力減弱越明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，但未呈現(xiàn)時間依賴性特征。見圖1。

圖1 不同藥物作用后MGC803細(xì)胞的體外生長曲線Figure1 Growth curves of the MGC803 cells after treated with different drugs

2.2 不同用藥方式對MGC803細(xì)胞侵襲能力的影響 與對照組相比，各用藥組MGC803細(xì)胞的侵襲能力均受到抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與紫杉醇比較，rh-ES100組和rh-ES200組細(xì)胞的侵襲能力減弱更為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。各聯(lián)合組MGC803細(xì)胞侵襲能力明顯低于對應(yīng)濃度rh-ES組(P＜0.01)，且聯(lián)合組中細(xì)胞侵襲抑制率較紫杉醇組減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。不論是rh-ES還是聯(lián)合組，隨著rh-ES濃度的增加，對細(xì)胞侵襲抑制作用增強，且呈劑量依賴性，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。

表1 不同用藥方式作用24 h后MGC803細(xì)胞的侵襲能力比較(±s)Tabel 1 Invasion ability of the MGC803 cells after treated with different drugs(±s)

表1 不同用藥方式作用24 h后MGC803細(xì)胞的侵襲能力比較(±s)Tabel 1 Invasion ability of the MGC803 cells after treated with different drugs(±s)

與對照組比較，*P＜0.01;與紫杉醇組比較，#P＜0.05;與上一濃度組比較，△P＜0.01;與對應(yīng)濃度rh-ES組比較，▲P＜0.01

?

2.3 用藥后 MGC803細(xì)胞 VEGF、MMP-2以及MMP-9蛋白表達(dá)情況 胃癌MGC803細(xì)胞經(jīng)不同用藥方式作用后，VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)量較對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。無論在rh-ES還是聯(lián)合組中，隨著rh-ES濃度增加，VEGF、MMP-2以及 MMP-9蛋白分別與β-actin蛋白的灰度值比值呈逐漸下降的趨勢，提示VEGF、MMP-2以及MMP-9蛋白受到藥物的抑制作用，表達(dá)量降低，且呈劑量依賴性。rh-ES100組和rh-ES200組VEGF以及MMP-2蛋白表達(dá)水平較紫杉醇組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，rh-ES50組與紫杉醇組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。rh-ES各組MMP-9蛋白表達(dá)水平較紫杉醇組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與紫杉醇組比較，聯(lián)合組VEGF、MMP-2以及 MMP-9蛋白量相對較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2，表2。

圖2 不同藥物作用后細(xì)胞VEGF，MMP-2以及MMP-9蛋白的表達(dá)Figure2 The VEGF，MMP-2 and MMP-9 protein expression of the MGC803 cells after treated with different drugs

表2 藥物作用后細(xì)胞VEGF、MMP-2以及MMP-9蛋白相對表達(dá)量的變化(±s)Tabel 2 Relative expression levels of the VEGF，MMP-2 and MMP-9 protein after treated with different drugs(±s)

表2 藥物作用后細(xì)胞VEGF、MMP-2以及MMP-9蛋白相對表達(dá)量的變化(±s)Tabel 2 Relative expression levels of the VEGF，MMP-2 and MMP-9 protein after treated with different drugs(±s)

與對照組比較，*P＜0.01;與紫杉醇組比較，#P＜0.05;與上一濃度組比較，△P＜0.05;與對應(yīng)濃度 rh-ES單藥組比較，▲P ＜0.05

組 別 VEGF/β-actin MMP9/β-actin MMP2/β-actin對照組0.640 ±0.044 0.607 ±0.077 0.640±0.481紫杉醇組 0.528 ±0.018* 0.457 ±0.037* 0.543±0.021*rh-ES50 組 0.517 ±0.295* 0.489 ±0.013* 0.523±0.029*rh-ES100 組 0.455 ±0.044*#△ 0.425 ±0.250* 0.431±0.024*#△rh-ES200 組 0.395 ±0.197*#△ 0.418 ±0.034* 0.424±0.036*#聯(lián)合50 組 0.420 ±0.374*#▲ 0.368 ±0.023*#▲ 0.379±0.027*#聯(lián)合100 組 0.364 ±0.020*#▲ 0.297 ±0.015*#△▲ 0.364±0.016*#▲聯(lián)合200組 0.306±0.033*#△▲ 0.241±0.032*#▲ 0.285±0.016*#△▲

3 討 論

抗血管生成治療成為抑制腫瘤生長新方法，目前應(yīng)用于臨床治療的抗血管生成藥物包括貝伐珠單抗、舒尼替尼、阿帕替尼、rh-ES等。目前晚期進展期胃癌的主要治療手段是化療，有效的化療藥物包括紫杉類、蒽環(huán)類、鉑類、氟尿嘧啶等，細(xì)胞毒性藥物的聯(lián)合方案并未從根本上提高化療的有效率，患者的中位生存期仍然很短［4］。40%～60%胃癌患者有VEGF表達(dá)，VEGF高表達(dá)者預(yù)后較陰性者差［5］，MMP-9高表達(dá)患者中位生存期(3.6個月)也較陰性者(10.5 個月)短(P ＜0.01)［6］，特別是未分化癌和印戒細(xì)胞癌患者的新生血管形成更加活躍［5］，因此胃癌的抗血管生成治療成為了臨床治療的熱點。

阿帕替尼是由我國研發(fā)的針對VEGF受體的口服小分子酪氨酸激酶抑制劑。Li等［7］報道了阿帕替尼850 mg/d組的無進展生存期和總生存期較安慰劑組顯著延長。Ramucirmab是一種靶向VEGFR-2的全人源IgG1單克隆抗體，胃癌一線治療后進展的患者經(jīng)Ramucirmab單藥治療的中位總生存期和無進展生存期明顯優(yōu)于安慰劑組［8］。但是，抗血管形成通路拮抗在胃癌的治療上顯得舉步維艱。特別是抗血管靶向治療聯(lián)合化療至今未能被證實臨床獲益。舒尼替尼為多靶點的抗血管形成小分子酪氨酸激酶抑制劑，是晚期腎細(xì)胞癌抗血管形成治療的重要藥物。但在FOLFIRI和FOLFIRI聯(lián)合舒尼替尼治療胃癌的II期研究中［9］，發(fā)現(xiàn)增加舒尼替尼僅增加血液學(xué)毒性。貝伐珠單抗針對VEGF單靶點發(fā)揮作用，與化療聯(lián)合能夠顯著改善轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的總生存期和無進展生存期;然而，胃癌患者未能從貝伐珠單抗聯(lián)合化療中獲益［10］。推測其原因可能與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移方式更多，新生血管形成涉及更多的細(xì)胞因子和信號通路等有關(guān);而抗血管形成多靶點TKI與化療聯(lián)合時毒性疊加、療效相互拮抗。

rh-ES具有多靶點抗血管特征，通過作用血管內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)節(jié)促血管形成因子、抗血管生長因子、MMP等因子的表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤抗轉(zhuǎn)移作用，同時比貝伐珠單抗、阿柏西普以及舒尼替尼等不良反應(yīng)低，與化療聯(lián)合并不增加其毒性，耐受性好。王金萬等［11］報道rh-ES作用于非小細(xì)胞肺癌能夠明顯改善患者總的中位疾病進展時間、臨床受益反應(yīng)和有效率。對于血流豐富、以血行轉(zhuǎn)移為主要轉(zhuǎn)移途徑的骨肉瘤，聯(lián)合rh-ES可提高化療對骨肉瘤的治療療效，且安全性較好［12］。陳建清等［13］報道 rh-ES 與化療藥物聯(lián)合使用治療肺癌以外的多種晚期難治性腫瘤具有良好的療效。本課題組在前期的臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，rh-ES聯(lián)合化療藥物治療晚期胃癌療效明顯，且不增加化療毒性，安全性高［14］。

rh-ES聯(lián)合紫杉醇可抑制MGC803的增殖能力，且作用具有相加效應(yīng)。經(jīng)不同濃度rh-ES處理后的MGC803穿過重建基底膜的能力明顯降低，呈劑量依賴性，提示rh-ES聯(lián)合化療藥物能顯著降低胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。通過蛋白印跡法檢測到用藥組與對照組相比，VEGF、MMP-2以及MMP-9蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，且隨著rh-ES用藥濃度的增加，各蛋白表達(dá)量下降越多，同時MGC803細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力減弱越明顯。推測rh-ES可能通過抑制MGC803細(xì)胞的VEGF、MMP-2以及MMP-9蛋白表達(dá)，降低其侵襲能力，而胃癌患者的預(yù)后與VEGF、MMP-9的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)［5-6，15-16］，推測 rh-ES 對上述血管形成通路關(guān)鍵因子的影響將對晚期胃癌的預(yù)后發(fā)生良性影響。

胃癌的轉(zhuǎn)移途徑包括淋巴道轉(zhuǎn)移［17］、腹膜轉(zhuǎn)移［18-21］、血行轉(zhuǎn)移［22］等。本研究也發(fā)現(xiàn) rh-ES 可明顯減少胃癌細(xì)胞MMP-2以及MMP-9蛋白表達(dá)，提示內(nèi)皮抑素聯(lián)合化療藥物可通過多種機制抑制胃癌細(xì)胞的各種途徑轉(zhuǎn)移。目前，本課題組針對胃癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的其他機制如VEGF分子的亞類(VEGF-A、VEGF-C)、bFGF、TGF-β(轉(zhuǎn)化生長因子)、整聯(lián)蛋白等進行研究，深入了解紫杉醇聯(lián)合rh-ES對高度侵襲性胃癌的作用機制。同時為了進一步證實紫杉醇聯(lián)合rh-ES對胃癌的作用，還將開展動物體內(nèi)實驗，明確紫杉醇聯(lián)合rh-ES抗胃癌轉(zhuǎn)移的作用及機制，為后續(xù)臨床研究提供依據(jù)。

總之，體外實驗研究表明rh-ES聯(lián)合紫杉醇能夠有效抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力，其機制可能與其能夠下調(diào)VEGF、MMP-2以及MMP-9蛋白表達(dá)有關(guān)。下一步將深入開展體外和體內(nèi)研究，進一步探討rh-ES聯(lián)合化療藥物抑制胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力及其可能的作用途徑和機制，以證實rh-ES聯(lián)合化療對胃癌治療的有效性，為開展臨床研究提供理論支持。

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