盧文朋，栗世方

0 引 言

在進行腦組織病理學(xué)實驗研究中，為避免組織細胞在自身溶酶體酶的作用下溶解破壞，盡量保持其抗原性，故動物處死前需行灌注固定處理。其目的就是快速、均勻地保存標本，以保持標本類似活體狀態(tài)［1］。在以往的操作基礎(chǔ)上，對大腦灌注固定技術(shù)做了進一步改進，并對操作過程中存在的問題，提出相應(yīng)措施。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 器械與試劑 止血鉗2把，組織剪、眼科剪各1把，皮鑷1把，輸液管2副(輸液器針頭的針尖掐斷，鈍圓即可)，等滲鹽水250 mL、4%多聚甲醛150 mL;小鼠抗 Neun單克隆抗體(Abcam公司，USA)、FITC標記的驢抗小鼠二抗(jackson公司，USA)。

1.1.2 實驗動物 健康成年 SD大鼠20只，8周齡，雄性，280～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號:SCXK(京)2012-0001，飼養(yǎng)環(huán)境(22±2)℃，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。實驗過程中對動物的處置符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標準。

1.2 方法步驟 ①將分別裝有等滲鹽水和4%多聚甲醛的輸液瓶懸吊于距離操作臺1.5 m高的位置［2－3］。② 麻醉顯效的大鼠仰臥于操作臺上，固定四肢及頭部，沿腹中線自劍突剪開皮膚，至下頜部，充分分離皮膚與皮下組織，暴露兩側(cè)胸廓。③游離胸前壁:止血鉗夾起胸骨劍突，在膈肌上方，循外上方向，剪開雙側(cè)胸廓至胸骨上部［1］，小心分離心包膜與胸骨間的系膜，將已游離的胸廓提起、固定。此時，胸腔可充分暴露，心臟及主動脈弓清晰可見(若主動脈弓被胸腺遮掩，可適當分離)。④夾閉胸主動脈:用皮鑷提起左側(cè)肺，可見其下位于大鼠脊柱左側(cè)的胸主動脈(胸主動脈右側(cè)為食管)，以止血鉗夾閉胸主動脈。⑤進針:左手捏持心臟，右手持眼科剪于心尖部剪開一淺口，將已剪除針尖的灌注針插入左心室并推送至升主動脈，固定使之不能退出。⑥灌注固定:打開調(diào)節(jié)閥，灌注等滲鹽水，剪開右心耳，觀察流出液體顏色，當流出液體清亮?xí)r，不拔出灌注針，更換輸液管，4%多聚甲醛進行固定，先快后慢，頸部僵硬后，說明灌注固定完成［4］。

2 結(jié) 果

2.1 主要優(yōu)點 ①可操作性強。手術(shù)操作空間大，出血量少，術(shù)野清晰;可以容易地發(fā)現(xiàn)胸主動脈并將其夾閉，避免了對腹部及下肢的固定;去除針尖的灌注針不易刺破心臟及血管，插至升主動脈，較單純插入左心室進行固定，效果明顯提高。②省時。從胸腔暴露至開始灌注時間約30 s，此時心臟搏動依然有力;灌注時間約5 min，此時右心耳流出清亮液體;固定開始后即可發(fā)現(xiàn)大鼠上肢及胡須抽動，約5 min后大鼠頸部僵硬，15 min完成固定。③省液。灌注液耗量80～100 mL;固定液耗量約80 mL。

2.2 固定后效果 大鼠只有頭部及上肢固定并僵硬，腹部和下肢并未固定，鼠尾依然柔軟。固定后，腦組織冰凍切片行免疫熒光檢測，正置熒光顯微鏡下神經(jīng)元細胞核特異性抗原-Neun表達清晰，見圖1。

圖1 FITC標記Neun熒光照片(×200)Figure 1 The immunofluorescence picture of Neun labled by FITC(×200)

3 討 論

在有關(guān)腦組織的各種常規(guī)病理形態(tài)、免疫組化等實驗研究中需要對腦組織進行固定處理，以保持蛋白類抗原。因為腦組織耐氧能力差，抗原易發(fā)生變性，所以需要對腦組織快速固定［5－6］。整塊腦組織浸沒于固定液，因為固定液不能以相同的速度迅速到達組織的各個部位，所以固定效果差［7－8］。通過大鼠天然的循環(huán)系統(tǒng)直接進行灌注固定，因固定液可快速、均勻地分布到腦組織各個部位，所以腦組織標本制備多采用此法［9－10］。關(guān)于進針方式目前主要有2種［11］:①經(jīng)頸總動脈灌注固定，注射針針尖向著頭部的方向注入固定液，液體的出口開在頸靜脈或左心房上;②在心尖部位進針;打開胸腔，用針頭插入左心室，同時右心房開一孔。第1種方法技術(shù)難度大，成功率低，故常不用;第2種方法操作相對簡便，雖幾經(jīng)完善，但存在操作難度大、耗時耗液、固定效果不佳等多處不足。陳浩宇等［12］采用夾閉腹主動脈，代小思［13］采用夾閉胸主動脈與主動脈弓交界處等方法均存在操作繁瑣且耗時較長的缺點，且未對開胸及進針方法行具體描述。Gage等［1］詳細描述了開胸方法，但對全身進行灌注固定，存在耗時、耗液的不足。本方法進一步改善灌注固定方法，使其基本完善。創(chuàng)新性主要體現(xiàn)在:改變以往開胸術(shù)式、夾閉胸主動脈及處理灌注針頭。針對上述3點，有關(guān)注意事項:①充分游離胸前壁，操作過程中動作輕柔，剪至胸骨角處，暴露心臟及主動脈弓;②夾閉胸主動脈，提起左側(cè)肺臟，可清楚看到位于脊柱左側(cè)的胸主動脈，其右側(cè)為食管，需要注意，避免錯夾;③插灌注針，未經(jīng)處理的輸液管針頭，因過于鋒利，易插破心臟和血管，在該操作中用眼科剪在心尖部剪開的深度要淺，防止剪破心臟，影響灌注固定效果，通過剪口，插入灌注針，動作要輕慢，針尖方向略偏左側(cè)，以免刺入右心房，灌注針進入升主動脈后，可明顯看到其位置，稍加固定，防止滑脫。若對心臟進行固定，可采用股動脈灌注方法［14］，Kasukurthi等［15］報道浸泡固定和經(jīng)心灌注固定對周圍神經(jīng)的實驗結(jié)果沒有明顯差異。總之，該方法針對腦組織等灌注固定具有可操作性強、省時、省液、提高灌注固定效果的優(yōu)點，值得推廣。

［1］Gage GJ，Kipke DR，Shain W.Whole animal perfusion fixation for rodents［J］.J Vis Exp，2012，30(65):1-9.

［2］高永強，楊巧蓮，王 偉.大鼠局灶性腦缺血模型制備及取腦方法實驗研究［J］.包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，25(4):6-9.

［3］賀莉萍，郭 毅，蒙艷斌，等.固定劑和固定時間對石蠟包埋組織RT-PCR檢測病毒RNA的影響［J］.國外醫(yī)學(xué)·流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊，2005，32(1):11-15.

［4］李晶晶，朱 鴻，施彩虹.三種方法對大鼠視網(wǎng)膜固定效果的比較研究［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2011，31(8):1105-1107.

［5］Zwienenberg M，Gong Q，Lee LL，et al.CP Monitoring in the Rat:Comparison of Monitoring in the Ventricle，BrainParenchyma，and Cisterna Magna［J］.J Neurotrauma，1999，16(11):1095-1102.

［6］王忠城.腦血管病及其外科治療［M］.北京:北京出版杜，1994:13-14.

［7］Kasukurthi R，Brenner MJ，Moore AM，et al.Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration［J］.J Neurosci Methods，2009，184(2):303-309.

［8］Jonkers BW，Sterk JC，Wouterlood FG .Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device［J］.J Neurosci Methods，1984，12(2):141-149.

［9］陳玉璽，王曉莉，牟青杰，等.骨髓間充質(zhì)干細胞對腦缺血大鼠星形膠質(zhì)細胞影響的實驗研究［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2013，26(6):564-567.

［10］李 丹，王志萍，宗 劍，等.富氫液聯(lián)合淺低溫對大鼠腦缺血再灌注海馬氧化應(yīng)激水平的影響［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2012，25(1):26-30.

［11］Stemmer WP.Rapid evoIution of a protein in uitro by DNA shuffIing［J］.Nature，1994，370(6488):389-391.

［12］陳浩宇，高亞兵，彭瑞云，等.一種改進的大鼠腦組織灌注固定方法［J］.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2002，26(3):208-212.

［13］代小思.腦組織局部灌注固定的改良及體會［J］.四川解剖學(xué)雜志，2004，12(1):38.

［14］周傳龍，方劍喬，邵曉梅.大動物灌注固定方法的探討［J］.實驗動物科學(xué)，2010，27(1):70-71.

［15］Kasukurthi R，Brenner MJ，Moore AM，et al.Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration［J］.J Neurosci Methods，2009，184(2):303-309.