孟天嬌,姜亞磊,閆曉英,狄 烊,金 宏，齊 玲 (吉林醫(yī)藥學(xué)院：.臨床本科班，2.實驗中心，.病理教研室，吉林 吉林 20)

五味子在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，具有收斂、固澀、名目、益氣生津、補腎寧心的作用，是中醫(yī)常用的滋補強壯藥。五味子多糖(Fructus Schisandrae Polysaccharide，F(xiàn)SP)是木蘭科植物五味子干燥成熟果實的提取物，一般沒有精確的分子量。研究顯示五味子多糖對腫瘤具有明顯的抑制作用，但現(xiàn)今還不是十分清楚其具體抑制腫瘤增殖的機制。本實驗通過對FSP作用后腦膠質(zhì)瘤細胞的研究，初步探討FSP對腦膠質(zhì)瘤細胞抑制作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑

FSP(北華大學(xué)提供)；小牛血清(Gibco公司)；0.25%胰酶(Gibco公司)；超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；bax、Bcl-2及Caspase-3抗體(北京中杉)。

1.2 人腦膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)

將腦膠質(zhì)瘤SHG-44細胞接種于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2及飽和濕度下進行培養(yǎng)，隔日換液。觀察膠質(zhì)瘤細胞生長狀況，當細胞生長密度大于90%，進行細胞的傳代培養(yǎng)，3代以后的腦膠質(zhì)瘤細胞用于實驗。

1.3 人腦膠質(zhì)瘤SHG-44細胞(和上清)SOD的測定

將濃度分別為0、200、400、800 μg/mL的藥物作用于膠質(zhì)瘤細胞，72 h后分別收集上清液和細胞，測定兩者SOD活力；分為對照孔、對照空白孔、上清測定孔、細胞測定孔、細胞測定空白孔和上清測定空白孔，振蕩器震蕩混勻，37℃，30 min，450 nm測定。在測定細胞SOD活力時，需要測定細胞蛋白濃度，通過超聲破碎的方法實現(xiàn)。

1.4 人腦膠質(zhì)瘤SHG-44細胞GSH的測定

測定試劑盒來自南京建成生物工程研究所；將收集好的細胞，用PBS清洗1-2次后，低速離心收集沉淀細胞，再加入0.3～0.5 mL 0.1 mol/L pH7.4的等滲PBS緩沖液懸浮細胞，超聲研磨破碎細胞，分別設(shè)置空白孔、標準孔和測定孔；混勻，靜置5 min，405 nm處酶標儀測定各孔吸光度值。

1.5 ELISA法測定人腦膠質(zhì)瘤SHG-44上清bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白

將相同密度的SHG-44腦膠質(zhì)瘤細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，實驗分為空白組(不含藥物)和用藥組(濃度分別為200、400、800 mg/L)，作用72 h。取細胞培養(yǎng)上清，與包被液按1∶1比例包被后4 ℃過夜。封閉后分別加入bax、Bcl-2、及Caspase-3抗體(1∶500稀釋)4 ℃過夜。加入二抗(1∶1 000稀釋)室溫下孵育2 h，室溫避光顯色，有顏色變化時終止顯色。自動酶標儀492 nm處測定吸光度(A)值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 腦膠質(zhì)瘤SHG-44細胞SOD和GSH變化

不同的濃度的FSP作用于膠質(zhì)瘤細胞48 h之后,比較SOD活力，濃度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與空白組相比，用藥組SOD活力偏低。

GSH測定結(jié)果顯示,實驗中800 mmol/L濃度加藥組降低顯著，具體變化可以看出，在加入FSP后，出現(xiàn)一個明顯的GSH耗竭現(xiàn)象，而GSH的損耗可以啟動腫瘤細胞凋亡(表1)。

2.2 FSP作用下凋亡蛋白bax、Bcl-2、Bcl-2/bax及Caspase-3的作用

濃度為800的實驗組細胞Caspase-3和bax含量顯著上升，Bcl-2含量顯著下降(P<0.01)，同時Bcl-2/bax比例的下降，也提示凋亡的進行(表2)。

表 1 FSP對腦膠質(zhì)瘤SHG-44 SOD和GSH影響

表 2 FSP作用下凋亡蛋白等的作用

3 討 論

細胞凋亡是基因調(diào)控下的細胞主動死亡，又稱程序化細胞死亡，其伴隨著細胞質(zhì)濃縮、細胞核崩裂、微粒消失、細胞膜皺縮、染色質(zhì)濃縮繼而解體、DNA裂解，最后形成凋亡小體。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤不僅存在細胞增殖，同時也存在細胞凋亡受阻，二者的不平衡狀態(tài)是導(dǎo)致腫瘤惡性生長的基礎(chǔ)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)p38γ可能作為致癌因子促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長和發(fā)展[3]，miR-107的表達可以抑制細胞膠質(zhì)瘤的增殖[4]，可以看出當細胞失去凋亡的能力便可引起腫瘤。從中我們是否可以通過藥物作用于腫瘤細胞的某個特定的靶點來抑制腦膠質(zhì)瘤細胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡，同時在不傷害正常組織的前提下達到抵抗腫瘤的目的，以提高患者的生存質(zhì)量。本實驗在倒置顯微鏡下觀察，不同濃度的五味子多糖均能在一定程度上抑制腦膠質(zhì)瘤細胞的增值，推測五味子多糖的抑瘤作用可能不是直接殺死瘤細胞，而與細胞凋亡及活化免疫細胞有關(guān)。

SOD是能夠有效清除超氧化物陰離子自由基的一類極重要的抗過氧化酶，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有一定的關(guān)系。在Ikeda通過自旋共振分光鏡測定神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中SOD活性，發(fā)現(xiàn)腫瘤中央?yún)^(qū)SOD活力低于周邊區(qū)[5],說明SOD活力降低程度與腫瘤呈現(xiàn)正相關(guān)的趨勢[6]。然而實驗結(jié)果中，用藥組倒置顯微鏡下觀察腫瘤細胞生長抑制明顯，但腫瘤細胞內(nèi)SOD活力并沒有提升，反而有所下降，推測其中的原因:1)在Nakada測定的胃癌細胞和Oherley測定的肝癌細胞中SOD含量顯著提高，推測其在不同性質(zhì)的腫瘤細胞中，由于細胞的生理功能的差異和環(huán)境等因素的影響，使SOD作用途徑發(fā)生改變，從而改變細胞SOD測定活力;2)在常規(guī)條件下，由于腫瘤細胞的異常增殖產(chǎn)生大量的自由基，從而消耗SOD的含量[7]。因此情況不同，實驗結(jié)果也可能不同，對于FSP是否通過影響SOD含量來影響人腦膠質(zhì)瘤細胞的凋亡還有待研究。

谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是構(gòu)成人體活性氧清除系統(tǒng)的主要抗氧化酶之一，可清除體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物，減少活性氧對機體的損傷作用[8]。有研究提出完整的GSH不能通過腫瘤細胞膜，從而導(dǎo)致腫瘤細胞內(nèi)GSH水平不升高[9]，而實驗中用藥組GSH含量明顯降低，其機制可能是FSP誘發(fā)了GSH耗竭現(xiàn)象[10]。GSH的耗竭是細胞凋亡信號傳導(dǎo)的一個重要環(huán)節(jié)，可以通過間接以活性氧(ROS)為第二信使誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，即通過激活核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)等轉(zhuǎn)錄因子，破壞細胞膜生理功能，進而促使磷脂酰絲氨酸(PS)從膜內(nèi)暴露出膜外，誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡[11]。

Caspase為半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase)的簡稱。參與細胞因子成熟、細胞生長和分化，并與細胞凋亡緊密相關(guān)，而Caspase-3是其中級聯(lián)反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)[12-16],是引起細胞凋亡的關(guān)鍵性激酶，參與細胞凋亡的重要成分。Bcl-2是一種造血系統(tǒng)疾病中的原癌基因，其高表達可使膠質(zhì)瘤細胞有更多機會逃避抗腫瘤藥物或者化療導(dǎo)致的細胞凋亡，當細胞成熟或凋亡時低表達甚至不表達[17]；bax是Bcl-2家族的成員，其表達的蛋白與Bcl-2的作用相反，腫瘤細胞的凋亡情況取決于兩種蛋白的表達比例[18]。這些蛋白含量的變化都能在一定程度上顯示用藥組腦膠質(zhì)瘤細胞凋亡的情況。實驗中，ELISA結(jié)果顯示FSP對SHG-44腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖抑制作用具有時間和濃度的依賴性，即在48 h后400 mmol/L以上具有明顯的抑制作用；濃度為800的FSP作用之后細胞Caspase-3和bax含量顯著上升，Bcl-2含量顯著下降(P<0.01)。其機制可能是FSP激發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)(oxidative stress)，上調(diào)procaspase-3與Caspase-8，在不影響Caspase轉(zhuǎn)錄水平的表達下誘導(dǎo)細胞凋亡；也可能直接激活Caspase3，通過GSH耗竭誘導(dǎo)細胞凋亡[19]。然而其具體通過什么方式影響腦膠質(zhì)瘤細胞的凋亡，還有待學(xué)者進一步探討和研究。

[1] Wamaru A,Iwado E,Kondo S,et al.Eupalmerin acetate a novel anticancer agent from Caribbean gorgonian octocorals induces apoptosis in malignant glioma cells via the c-jun NH2-teminal kinase pathway[J].Mol Cancer Ther,2007,6(1):184-192.

[2] Jiang Hao,Zhang Lijie,Kuo J,et al.Resveratrol induced apoptotic death in human U251 glioma cells[J].Mol Cancer Ther,2005,4(4):554-561.

[3] He Jie,Zhang Wanyu,Zhou Qiangqiang,et al.Low-expression of microRNA-107 inhibits cell apoptosis in glioma by upregulation of SALL4[J].Int J Biochem Cell Biol,2013,45(9):1962-1973.

[4] Yang Kui,Liu Yunsheng,Liu Zhixiong,et al.p38γ overexpression in gliomas and its role in proliferation and apoptosis[J].Sci Rep,2013,3:2089.

[5] Ikeda Y,Long D M.Oxygen free radicals in the genesis of peritumoural brain oedema in experimental malignant brain tumours[J].Acta Neurochir Suppl (Wien),1990,51:142-147.

[6] 郭世文，劉守勛，何百祥，等.檢測腦膠質(zhì)瘤患者血、腦脊液SOD活力及LPO含量的意義[J].腫瘤防治研究,2002,29(3):208-209.

[7] 趙心同,趙洪洋,姚東曉,等.腦膠質(zhì)瘤治療中自由基清除劑的價值[J].中華腫瘤防治雜志,2011,18(8):571-574.

[8] Ceruti P A.Prooxidant states and tumor promotion[J].Science,1985,27(4685):375-381.

[9] Paolicchi A,Pompella A,Tonarelli P,et al.Gamma glutamyltranspeptidase activity in human ovarian carcinoma[J].Anticancer Res,1996,16(5B):3053-3058.

[10] 王靜麗,趙臨襄,景永奎.谷胱甘肽的耗竭與腫瘤細胞凋亡[J].中國藥物化學(xué)雜志,2003,13(6):361-366.

[11] Miller W H Jr.Molecular targets of arsenic trioxide in malignant cells[J].Oncologist,2002,7(Suppl 1):14-19.

[12] Ohba H,Moriwaki S,Bakalova R,et al.Plant-derived abrin induces apoptosis in cultured leukemic cell lines by different mechanismis[J].Toxicol Appl Phamacol,2004,195(2):182-193.

[13] Way T D,Kao M C,Lin J K.Degradation of HER2/neu by apigenin induces apoptosis through cytochrome release and caspase-3 activation in HER2/neu-overexpressing breast cancer cells[J].FEBS Lett,2005,579(1):145-152.

[14] Woo D H,Han I S,Jung G.Mefenamic acid-induced apoptosis in human liver cancer cell-lines through Caspase pathway[J].Life Sci,2004,75(20):2439-2449.

[15] Soto-Cerrato V,Liagostera E,Montaner B,et al.Mitochondria mediated apoptosis operating irrespective of multidrug resistance in breast canter cells by the anticancer agent prodigiosin[J].Biochem Phamacol,2004,68(7):1345-1352.

[16] Kaznelson D W,Bruun S,Monrad A,et al.Simultaneous human papilloma virus type 16 E7 and cdk inhibitor p21 expression induces apoptosis and cathepsin B activation[J].Virology,2004,320(2):301-312.

[17] Petit A,Mwale F,Zukor D J,et al.Effect of cobalt and chromium ions on bcl-2,bax,caspase-3 and caspase-8 expression in human U937 macraophages[J].Biomarials,2004,25(11):2013-2018.

[18] Jacobson M D.Reactiv Oxygen spcies and programmed cell death[J].Trend Biochem Sci,1996,21(3):83-86.

[19] Coffey R N,Watson R W,Hegarty P K,et al.Priming prostate carcinoma cells for increased apoptosis is associated with up-regulation of the caspases[J].Cancer,2001,92(9):2297-2308.