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腎細(xì)胞癌中基質(zhì)金屬蛋白酶-12 mRNA的表達(dá)及臨床意義

2014-08-17 08:44:06解放軍第222醫(yī)院吉林吉林132011
關(guān)鍵詞:胞外基質(zhì)定量標(biāo)本

蒲 波,陳 穎 (解放軍第222醫(yī)院,吉林 吉林 132011)

腎細(xì)胞癌(Renal Cell Carcinoma,RCC)是最常見的惡性腫瘤之一,起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng),約占所有腎臟惡性腫瘤的90%[1]。世界腫瘤統(tǒng)計(jì)顯示,腎細(xì)胞癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),每年全球有約20萬(wàn)例新發(fā)腎細(xì)胞癌,并且有超過(guò)10萬(wàn)例腎細(xì)胞癌病例死亡[2]?;|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallopmteinases, MMPs)是一類高度保守的生物活性依賴于鋅離子、有降解細(xì)胞外基質(zhì)能力的蛋白水解酶家族,目前已發(fā)現(xiàn)28個(gè)家族成員[3]。MMPs由5個(gè)功能不同的結(jié)構(gòu)域組成:疏水信號(hào)肽序列、前肽區(qū)、催化活性區(qū)、富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)和羧基末端區(qū)[4]。由于MMPs能降解細(xì)胞外基質(zhì)幾乎所有的成分,傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為MMPs在腫瘤中的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程發(fā)揮了重要作用。在腎細(xì)胞癌中,有研究顯示MMP2、MMP-7和MMP-9在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)水平較正常組織升高,并且與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[5]。而MMP-12作為基質(zhì)裂解素亞家族的一員,最初是在人肺泡巨噬細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn),無(wú)活性形式的MMP-12是分子量為5.4×104大小的蛋白,在去氮端和碳端后變?yōu)榉肿恿?.2×104的活性形式[6]。MMP-12的活性使其可以降解Ⅳ型膠原、纖維蛋白、層粘連蛋白、玻連蛋白、蛋白聚糖類、硫酸軟骨素和髓磷脂堿性蛋白。這種活性使得MMP-12在細(xì)胞外基質(zhì)降解、組織重構(gòu)以及相應(yīng)的腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中可發(fā)揮重要作用[6]。但是到目前為止,MMP-12在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)模式以及與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系仍未見報(bào)道。因此,在本研究中我們檢測(cè)了腎細(xì)胞癌和正常組織中MMP-12的表達(dá)水平,使用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其表達(dá)差異以及與腎細(xì)胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

在知情同意的原則下,取2012-2013年確診的腎細(xì)胞患者50例,所有病例在采血前均未接受過(guò)任何放療、生物或免疫治療。所選取的腎細(xì)胞癌的病理診斷均經(jīng)過(guò)兩位高年資病理醫(yī)生確認(rèn)。正常組織標(biāo)本來(lái)源于16例經(jīng)手術(shù)的腎非腫瘤病例。

主要試劑和儀器:Trizol試劑;Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒;TAKARA實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒;ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)。MMP-12及GAPDH實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物使用primer 5設(shè)計(jì),全部引物均在北京奧科公司合成。

1.2 組織標(biāo)本收取及保存

常規(guī)于術(shù)后10 min內(nèi)在大體腫瘤標(biāo)本以及經(jīng)手術(shù)的非腫瘤病例標(biāo)本中切取部分標(biāo)本放于凍存管中,所有標(biāo)本經(jīng)液氮冷凍后放于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

使用Trizol(Invitrogen)進(jìn)行樣本中RNA的提取,在100 mg腫瘤及正常組織中分別加入預(yù)冷的Trizol Reagent 1 mL,勻漿后加入200 μL氯仿混勻,振蕩后靜置2 min;1.2×104g、4 ℃離心15 min后小心吸取上清,轉(zhuǎn)移至另一EP管后加入500 μL異丙醇,混勻后-20 °C過(guò)夜;第2天經(jīng)1.2×104g、4 ℃離心10 min后棄去上清,向沉淀中加入等體積的75%乙醇洗滌沉淀;1.2×104g、4 ℃離心20 min后棄去乙醇,室溫干燥10 min,所得RNA溶解于20 μL DEPC處理水,紫外分光光度計(jì)定量。每個(gè)總RNA樣品取5 μg,加入50 μmol/L oligo(dT)18 Primer 1 μL,加DEPC處理水至12 μL,70 ℃加熱5 min,冰上放置5 min 后,依次加入10 mmol/L dNTP混合液2 μL,5×reaction buffer 4 μL,20 u/μL Ribolock inhibitor 1 μL,混勻后37 ℃加熱5 min,加入200 u/μL Revert Aid M-MuLV Reverse Transcriptase 1 μL,42 ℃反應(yīng)60 min,70 ℃加熱10 min中止反應(yīng)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用ABI 7500型實(shí)時(shí)定量PCR儀。每種組織模板均加入MMP-12和內(nèi)參照GAPDH對(duì)應(yīng)的熒光定量PCR引物,其中MMP-12引物為5′-CGATGAGGAC GAATTCTGGACTAC-3′和5′-GGTTCTGAATTGTCAGG ATTTGGC-3′;內(nèi)參照GAPDH引物為5′-CCCATCACC ATCTTCCAGGAGCG-3′和5′-GGCAGGGATGATGTT CTGGAGAGCC-3′。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為25 μL,其中dNTP(2.5 pmol/μL)2 μL,上、下游引物各1 μL,MIX酶12.5 μL,cDNA 模板1 μL,SYBR 0.5 μL,去離子水補(bǔ)至25 μL,每個(gè)樣品均設(shè)1個(gè)復(fù)孔。在ABI 7500熒光定量PCR儀上按下列條件擴(kuò)增:95 ℃ 10 s預(yù)變性,然后95 ℃ 10 s,60 ℃34 s,共45個(gè)循環(huán)。程序設(shè)定在每一個(gè)循環(huán)的變性期后,記錄上一循環(huán)最后10%的平均熒光值,以表示PCR產(chǎn)物含量。反應(yīng)完成后調(diào)整基線循環(huán)和計(jì)算域值,采用2-ΔΔCt法比較NDRG1的相對(duì)表達(dá)量,儀器自動(dòng)根據(jù)得出的Ct計(jì)算得出代表相對(duì)表達(dá)量的RQ值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 MMP-12在腎細(xì)胞癌和正常腎組織中的表達(dá)

經(jīng)過(guò)相對(duì)表達(dá)計(jì)算,腎細(xì)胞癌組織中MMP-12的相對(duì)表達(dá)量為3.58±0.36,正常腎組織中MMP-12的相對(duì)表達(dá)量為1.06±0.12,兩者相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。說(shuō)明腎細(xì)胞癌中MMP-12的表達(dá)量顯著高于正常腎組織,MMP-12在腎細(xì)胞癌的發(fā)生過(guò)程中有可能起到促癌作用。

2.2 腎細(xì)胞癌中MMP-12表達(dá)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系

通過(guò)回顧50例腎細(xì)胞癌的臨床資料,將腫瘤根據(jù)不同的侵襲或轉(zhuǎn)移程度分組,使用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析檢測(cè)各組中MMP-12表達(dá)的差異。結(jié)果顯示,高侵襲力腎細(xì)胞癌組織中的MMP-12表達(dá)顯著高于低侵襲力腎細(xì)胞癌(P<0.001);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腎細(xì)胞癌組織中MMP-12的表達(dá)顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.001);有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腎細(xì)胞癌組織中MMP-12的表達(dá)顯著高于無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者(P<0.001)(表1)。說(shuō)明MMP-12在腎細(xì)胞中可能發(fā)揮促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。

表 1 腎細(xì)胞癌中MMP-12的表達(dá)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系

3 討 論

由于MMP-12最初是在人肺泡中被發(fā)現(xiàn)的,早期的研究主要局限于呼吸系統(tǒng),研究發(fā)現(xiàn)MMP-12的高表達(dá)是慢性阻塞性肺疾病發(fā)病的關(guān)鍵分子要素之一。隨后,由于MMP-12具有廣泛的細(xì)胞外基質(zhì)降解作用,對(duì)其的研究逐步擴(kuò)展到腫瘤領(lǐng)域,先后有研究發(fā)現(xiàn)MMP-12在食管癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌和子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)顯著高于相應(yīng)正常組織,而且在這些腫瘤中,MMP-12的表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7-8]。但是,截至目前,仍未見MMP-12在腎細(xì)胞癌中的研究報(bào)道。本研究系統(tǒng)檢測(cè)了腎細(xì)胞癌組織中MMP-12的表達(dá),結(jié)果顯示腎細(xì)胞癌組織中MMP-12的表達(dá)顯著高于正常組織,說(shuō)明MMP-12在腎細(xì)胞癌的發(fā)生過(guò)程中可能發(fā)揮促癌作用。除此之外,通過(guò)回顧臨床資料并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)高侵襲力腎細(xì)胞癌組織中MMP-12的表達(dá)顯著高于低侵襲力腫瘤;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腎細(xì)胞癌組織中MMP-12的表達(dá)顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者;有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腎細(xì)胞癌組織中MMP-12的表達(dá)顯著高于無(wú)轉(zhuǎn)移者(P<0.001),說(shuō)明MMP-12可能促進(jìn)腎細(xì)胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移。以上研究結(jié)果說(shuō)明,MMP-12在腎細(xì)胞癌中有望作為腫瘤早期診斷和侵襲轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物,進(jìn)而為腎細(xì)胞癌的早期診斷和個(gè)體化治療提供具有臨床價(jià)值的線索。

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