鄭驚雷 梁力建 王在國 陳劉鎮(zhèn) 胡夏榮 葉振偉

肝動脈灌注化療是肝癌常用的區(qū)域灌注化療方法，目前常作為肝癌術(shù)后治療和不能切除的晚期肝癌治療的重要手段。既往的研究提示經(jīng)肝動脈區(qū)域灌注化療可顯著提高肝臟組織藥物濃度，同時達到減少藥物在外周血和全身其他部位分布[1]?；熕幬镆种颇[瘤血管生成是抗腫瘤的重要機制，本文以5-Fu為化療代表藥物，通過對肝癌大鼠進行肝動脈區(qū)域灌注化療，研究其對腫瘤血管生成的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 兔抗鼠CD34多克隆抗體，VEGF多克隆抗體，武漢博士德有限公司生產(chǎn)。DAB顯色試劑盒，SP即用型試劑盒，PBS緩沖液，福州邁新有限公司生產(chǎn)。5-FU由南通精華制藥公司提供，批號：070402，規(guī)格10 mL：0.25 g。

1.2 腫瘤細胞株和實驗動物 CBRH-7919大鼠肝癌細胞株，中山大學細胞保藏中心提供。（1）BALB/c雄性裸鼠2只，17.1～19.6 g重，作種鼠皮下接種腫瘤細胞。（2）Wistar雄性大鼠18只，（120±15）g重，作肝內(nèi)種植腫瘤用。上述動物均為SPF（無特定病原）級，由中山大學動物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 大鼠肝癌模型的建立 將培養(yǎng)好的大鼠肝癌細胞注射于裸小鼠背部皮下，2周后成瘤并取出，切成l mm×l mm×1 mm瘤塊。然后采用肝內(nèi)隧道植入法將瘤塊接種于Wistar大鼠肝左葉。手術(shù)當天始腹腔注射氫化可的松2 mg/只/d×5 d。術(shù)后密切觀察造模后荷瘤大鼠的生物學行為、死亡情況等。

1.3.2 實驗分組及給藥 造模2周后，將18只荷瘤大鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組（不作任何處理）、外周靜脈組經(jīng)尾靜脈注射）、肝動脈組（經(jīng)胃十二指腸動脈插管至肝動脈給藥），6只/組。大鼠的5-FU給藥劑量為20 mg/kg，連續(xù)給藥4 d。

1.3.3 標本采集和處理 化療結(jié)束后第7天處死大鼠摘除肝臟腫瘤組織，并置于10%福爾馬林中固定后石蠟包埋。將瘤體石蠟標本塊切片，厚度約5 μm。脫蠟后通過微波加熱法修復(fù)抗原，予免疫組織化學染色。每例標本取2張切片，滴加CD34抗體和VEGF多抗各1滴。

1.3.4 VEGF檢測 標本經(jīng)染色封片后在顯微鏡下（×200）觀察，細胞漿顯示棕黃色顆粒為VEGF陽性細胞。每張切片選陽性表達最高的5個高倍視野（×400）照相，采用IPP 圖像分析軟件將VEGF蛋白染色的黃色區(qū)域作為AOI area of interest）測定分析光密度。取5個視野的積分光密度（IOD）平均值作為該標本的表達強度計量值。

1.3.5 MVD檢測 參照Weidner的標準計算各組腫瘤內(nèi)的微血管密度（MVD）：低倍鏡下（×100）尋找切片中棕黃染色密度最高的區(qū)域，即為富含血管組織的“熱點”區(qū)。再在高倍鏡下（×400）按染色為棕黃色的內(nèi)皮細胞均記為一條獨立血管的標準計算血管數(shù)目。每張切片分別選10個不同高倍視野計算MVD，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肝癌組織VEGF表達比較 細胞漿內(nèi)染色為棕黃色為陽性。各組陽性染色深淺不均，肝動脈組較淺，外周靜脈組次之，對照組染色最深。圖像分析后比較，結(jié)果顯示對照組VEGF表達明顯高于外周靜脈組和肝動脈組，且肝動脈組的肝癌VEGF表達明顯低于外周靜脈組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 各組肝癌組織CD34的表達及MVD結(jié)果比較 各組MVD具有相似的分布特征：腫瘤血管內(nèi)皮細胞被染成棕黃色，且分布不均勻，壞死組織周圍及腫瘤邊緣MVD相對較高。肝動脈組的肝癌組織CD34蛋白表達和MVD最低，均明顯低于外周靜脈組和對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而外周靜脈組和對照組的CD34蛋白表達和MVD比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

表1 各組大鼠肝癌組織的VEGF表達和MVD比較（±s）

表1 各組大鼠肝癌組織的VEGF表達和MVD比較（±s）

*與對照組比較，P<0.05；△與外周靜脈組比較，P<0.05

組別 VEGF（IOD值） MVD對照組 46351.48±2926.24 69.74±16.60外周靜脈組 43678.84±2852.76* 62.08±10.77肝動脈組 35518.86±2657.16*△ 36.26±8.43*△

3 討論

區(qū)域灌注化療可以增加癌灶和靶組織器官的化療藥物濃度和/或降低外周血及其他組織的藥物分布，是目前實體腫瘤化療增效減毒的重要措施和手段之一[1-2]。肝動脈灌注化療由于具有較明顯的藥動學優(yōu)勢，常作為肝癌化療的常用手段[3-4]。原發(fā)性肝癌（HCC）是典型的富血供惡性腫瘤，它的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移時刻離不開腫瘤新生血管。腫瘤血管生成是HCC生長和轉(zhuǎn)移的先決條件，如果腫瘤組織沒有新生血管支持，則因凋亡和壞死而腫瘤不會大于1～2 mm[5]。而肝癌預(yù)后則與癌組織的血管生成調(diào)節(jié)因子水平和微血管密度（MVD）密切相關(guān)[6-7]。

VEGF目前被認為是體內(nèi)最強的一種血管生成因子，其在肝細胞癌中呈高表達，與腫瘤的生長和預(yù)后緊密相關(guān)[8-10]。腫瘤微血管密度和VEGF的表達水平直接關(guān)聯(lián)，提示VEGF使腫瘤血管生成會導(dǎo)致肝癌的浸潤、生長轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。5-FU經(jīng)多年臨床應(yīng)用顯示毒副作用較小的對肝癌細胞敏感性較好的藥物，是肝癌化療目前最常用的藥物之一[11-12]。本實驗以5-FU作為化療代表藥物進行研究，結(jié)果顯示兩個化療組VEGF表達均明顯低于對照組（P<0.05），提示5-FU能抑制腫瘤細胞合成與分泌VEGF，減低其對血管內(nèi)皮細胞刺激所致的過度增生，同時通過控制VEGF分泌實現(xiàn)抑制肝癌細胞增殖，從而說明5-FU可使VEGF表達下調(diào)，使血管生成受抑制而控制腫瘤生長。肝動脈組的VEGF表達明顯低于外周靜脈組（P<0.05），說明肝動脈化療比外周靜脈給藥更能有效減低VEGF表達。筆者既往的研究顯示肝動脈灌注化療的肝組織藥物濃度明顯高于經(jīng)外周靜脈給藥，綜合提示了不僅化療可以抑制VEGF在肝癌組織中的表達，而且一定程度上5-FU的藥物濃度和VEGF在腫瘤組織中表達水平呈負相關(guān)[1]。

MVD是反映肝細胞癌腫瘤血管生成情況的一項指標[13-14]。CD34則是目前最敏感的腫瘤血管標記物[15]。本課題采用CD34對血管內(nèi)皮細胞進行標記來檢測腫瘤組織中的的MVD。研究結(jié)果顯示肝動脈組的肝癌組織MVD最低，均明顯低于對照組和外周靜脈化療組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；但對照組和外周靜脈組的MVD比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。提示肝動脈灌注化療可以有效降低肝癌組織的血管密度，而經(jīng)外周靜脈注射化療則對降低肝細胞癌腫瘤微血管密度，抑制腫瘤血管生成效果不顯著。綜上所述，肝動脈灌注化療能有效抑制肝癌組織VEGF表達，降低腫瘤MVD，從而抑制腫瘤血管生成。

[1]鄭驚雷，梁力建，胡文杰，等.區(qū)域性灌注化療時5-FU的血液和肝臟組織藥物濃度分布特征[J].南方醫(yī)科大學學報，2008，28（5）：823-827.

[2]Cagol P P，Pasqual E，Bacchetti S.Potential advantages of locoregional intra-arterial chemotherapy[J].In Vivo，2006，20（6A）：777-779.

[3]Nitta H，Beppu T，Imai K，et al.Adjuvant hepatic arterial infusion chemotherapy after hepatic resection of hepatocellular carcinoma with macroscopic vascular invasion[J].World J Surg，2013，37（5）：1034-1042.

[4]Giunchedi P，Maestri M，Gavini E，et al.Transarterial chemoembolization of hepatocellular carcinoma-agents and drugs：an overview.Part 2[J].Expert Opin Drug Deliv，2013，10（6）：799-810.

[5]Liu Y，Xu L，Zeng Q，et al.Downregulation of FGL2/prothrombinase delays HCCLM6 xenograft tumour growth and decreases tumour angiogenesis[J].Liver Int，2012，32（10）：1585-1595.

[6]Bao Y，F(xiàn)eng W M，Tang C W，et al.Endostatin inhibits angiogenesis in hepatocellular carcinoma after transarterial chemoembolization[J].Hepato-gastroenterology，2012，59（117）：1566-1568.

[7]Sharma B K，Srinivasan R，Kapil S，et al.Serum levels of angiogenic and anti-angiogenic factors：their prognostic relevance in locally advanced hepatocellular carcinoma[J].Mol Cell Biochem，2013，383（1-2）：103-112.

[8]Sengupta B，A Siddiqi S.Hepatocellular carcinoma：important biomarkers and their significance in molecular diagnostics and therapy[J].Curr Med Chem，2012，19（22）：3722-3729.

[9]Yegin E G，Siykhymbayev A，Eren F，et al.Prognostic implication of serum vascular endothelial growth factor in advanced hepatocellular carcinoma staging[J].Ann Hepatol，2012，12（6）：915-925.

[10]崔旭輝，薛學義，許寧.沙利度胺抗腫瘤血管生成作用及臨床研究進展[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2011，8（32）：158-160.

[11]湯釗猷.現(xiàn)代腫瘤學[M].上海：上海醫(yī)科大學出版社，2000：94-95.

[12]Nagano H，Kobayashi S，Marubashi S，et al.Combined IFN-α and 5-FU treatment as a postoperative adjuvant following surgery for hepatocellular carcinoma with portal venous tumor thrombus[J].Exp Ther Med，2013，5（1）：3-10.

[13]Wang Q，Tian X，Zhang C，et al.Upregulation of vasohibin-1 expression with angiogenesis and poor prognosis of hepatocellular carcinoma after curative surgery[J].Medical Oncology，2012，29（4）：2727-2736.

[14]杜國芳，王麗紅，裴毅.重組人血管內(nèi)皮抑制素抗小鼠肝癌H22作用機制探討[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2013，10（2）：14-15.

[15]Di Carlo I，F(xiàn)raggetta F，Lombardo R，et al.CD 34 expression in chronic and neoplastic liver diseases[J].Panminerva Med，2002，44（4）：365-367.