張朝順 柯常江 馮起校 邱海兵 覃善君

深靜脈血栓形成(DVT)指血液在深靜脈內不正常地凝結、阻塞管腔，導致的靜脈回流障礙，多發(fā)生于下肢深靜脈。西方國家每年因DVT住院人數(shù)約65 萬例，死亡人數(shù)約5～20 萬例，臺灣地區(qū)的DVT發(fā)生率約為歐美的2/3，大陸尚無對DVT發(fā)病情況的統(tǒng)計[1]。隨著人口老齡化，DVT發(fā)病率近年來呈明顯上升趨勢。DVT除可能引致肺栓塞(PTE)外，尚會導致慢性靜脈功能不全，引起慢性靜脈潰瘍、跛行等，影響患者生活質量，加重社會負擔[2]。DVT病變過程復雜，為明確其發(fā)病的機制及轉歸，建立合適的DVT動物模型，模擬其病理生理過程，是研究DVT的重要途徑。雖然目前已有多種DVT動物模型，但能很好的模擬人類DVT病理生理過程的動物模型仍較少。如何復制更符合臨床的DVT動物模型，是今后推進DVT防治研究的關鍵。我們通過不完全阻滯左股靜脈血流+注入10%高滲鹽水的方法，建立了一種簡單、穩(wěn)定且更符合臨床的大鼠DVT疾病模型，現(xiàn)將結果報道如下。

材料與方法

一、實驗動物

雄性清潔級SD大鼠144只，月齡4個月，體質量(350±27)g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，合格證號：SCXK(粵)2008-0002。SD大鼠飼養(yǎng)于動物中心實驗室動物房，室溫18～25℃，房間通風良好，實驗動物自由飲水及進食，適應性喂養(yǎng)1周后進入實驗。

二、動物分組

144只SD大鼠，按隨機原則分組，分為6組，每組24只。N組：正常對照組；S組：假手術組；V1組：不完全阻滯左股靜脈血流組；V2組：不完全阻滯左股靜脈血流+左下肢制動組；V3組：不完全阻滯左股靜脈血流+注入10%高滲鹽水1 ml組；V4組：不完全阻滯左股靜脈血流+注入凝血酶0.25 U(0.1 ml)組。

三、大鼠下肢深靜脈血栓形成模型的建立

N組(正常對照組)：不作任何操作。 S組(假手術組)：大鼠以5%水合氯醛(0.6 ml/100 g)腹腔注射麻醉，沿左腹股溝區(qū)中點行2 cm縱行切口，分離左股靜脈；術畢檢查周圍組織無出血后縫合切口，外敷消毒紗布。V1組：5%水合氯醛(0.6 ml/100 g)腹腔注射麻醉，沿左腹股溝區(qū)中點行2 cm縱行切口，分離左股靜脈；在左股靜脈近心端處繞以絲線不完全結扎，使血管腔縮小約1/2，以減慢血流。V2組：在V1組操作的基礎上，以石膏固定大鼠左下肢制動。V3組：在V1組操作的基礎上，自阻滯血管遠端緩慢注入10%高滲鹽水1 ml造成局部靜脈血管壁損傷(當靜脈輸入10%高滲鹽水時，血漿滲透壓升高，使血管內皮細胞脫水、低氧、充血、水腫，引起血管收縮與痙攣，進而使局部血小板聚集，并釋放血栓素A2等，靜脈壁通透性增高，白細胞浸潤并產生炎性改變，從而促進靜脈血栓形成[3])。V4組：在V1組操作的基礎上，自阻滯血管遠端緩慢注入凝血酶0.25 U。術后動物自由飲水，正常飼料飼養(yǎng)，不用抗凝劑及抗生素。

四、標本的獲取及處理

建模后第2、6、10日作為觀察時間點，在各觀察時間點每組各隨機取8只大鼠，對大鼠麻醉(麻醉方法同前)，切取結扎線下方股靜脈段約2 cm，用生理鹽水沖洗，再將股靜脈段放入10%甲醛溶液中固定，行蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察組織病理學改變，并計算血栓形成率。

五、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。組間率的比較采用χ2檢驗，按非獨立四格表顯著性界值進行判斷，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、實驗動物存活情況

144只受試大鼠中，S組在建模時因麻醉過量死亡1只，V4組在建模時因術中損傷股動脈致失血性休克死亡1只，其余142只大鼠均存活至完成實驗。

二、各組大鼠左下肢腫脹情況

各組大鼠左下肢腫脹情況見表1。

三、各組大鼠股靜脈血栓形成率的比較

光鏡觀察各組大鼠左股靜脈血栓形成結果見表2。術后各時間點，N、S組均未見血栓形成；術后第2日，V1組大鼠股靜脈血栓形成率為0%(0/8)，V2組25%(2/8)，V3組62.5%(5/8)，V4組28.6%(2/7)；術后第6日，V1組大鼠股靜脈血栓形成率為12.5%(1/8)，V2組50%(4/8)，V3組87.5%(7/8)，V4組62.5%(5/8)；術后第10日，V1組大鼠股靜脈血栓形成率為25%(2/8)，V2組50%(4/8)，V3組75%(6/8)，V4組37.5%(3/8)。V1組各時點的血栓形成率與N、S組比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2分別為1.422、1.335，P分別為0.233、0.248，均>0.05)。V3組血栓形成率高于N、S、V1、V2、V4組(χ2分別為28.8、27.957、19.048、5.486、4.846，P分別為<0.001、<0.001、<0.001、0.039、0.039，P均<0.05)。V2組血栓形成率高于N、S、V1組(χ2分別為12.632、9.813、5.169，P值分別為0.001、0.002、0.023，P均<0.05)，V4組血栓形成率高于N、S、V1組(χ2分別為10.786、12.778、5.633，P分別為0.001、0.001、0.018，P均<0.05)，而V2、V4兩組的血栓形成率比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.016，P=1.0>0.05)。

表1 各組大鼠左下肢腫脹發(fā)生情況(例數(shù))

表2 光鏡觀察大鼠左股靜脈血栓形成結果(以靜脈數(shù)表示)

四、各組大鼠局部股靜脈的組織形態(tài)學觀察

N組及S組大鼠在各時間點均無股靜脈血栓形成；光鏡觀察見整個血管內膜表面平整，內皮細胞大小均勻、排列整齊，管腔內無血栓形成，管壁無炎性細胞浸潤(圖1A、B)。V3組術后第2、6、10日，光鏡下股靜脈血栓病理形態(tài)見圖1C、D、E。

討 論

DVT尤其是下肢的DVT作為住院患者的一項嚴重疾病及常見并發(fā)癥已越來越受到重視，具有很高的致殘率及致死率[4-5]。國外文獻報道，DVT是繼急性冠脈綜合征和中風后的第三大心血管疾病，且其發(fā)病率近年來呈明顯上升趨勢[6]。許多DVT患者并發(fā)PTE和心血管意外從而導致嚴重后果[7]。因此，深入研究DVT的發(fā)病原因、致病機制以及相關的病理生理，對于改善診治現(xiàn)狀，降低并發(fā)癥發(fā)生及死亡率，具有良好的經濟和社會效益。而建立簡單、價格低廉、穩(wěn)定、可靠且符合臨床深靜脈血栓形成特點的DVT動物模型是研究該問題的基礎。雖然目前已有多種DVT動物模型，但有助于對DVT發(fā)病機制深入研究的動物模型仍較少。如何復制更符合臨床的DVT動物模型，是今后推進DVT防治研究的關鍵。

利用實驗動物制備DVT疾病模型的歷史由來已久，文獻報道有近60年的歷史，先后有多達18種動物用于模型制備[8]。理想的動物模型應具有類似于人類DVT的病因和病程，血栓應形成于下腔靜脈至股靜脈段，動物能夠站立并且站立時應足夠高以研究類似DVT患者的血流動力學變化，并且動物應足夠大以能夠進行外科治療方面的研究[9]。因此，與小鼠、大鼠、兔等小動物比較而言，豬、猴等大動物更接近人類的生理特點，可更好地用于DVT研究[10]。但大動物存在費用高、人員占用多、術后管理困難等缺點，而且常受倫理方面的約束，限制了廣泛應用。而小動物可解決上述問題，而且操作相對簡單，易于普及。因此，本實驗選取了SD大鼠制備DVT疾病模型。在造模血管選取方面，目前研究已證實，DVT以下肢最常見，初始血栓形成的主要部位包括髂靜脈、股靜脈、腘靜脈、脛后靜脈、腓靜脈，而PTE的栓子主要來源于盆腔靜脈、股靜脈和腓靜脈[11]。因此，選擇股靜脈制備DVT模型最理想，更接近臨床靜脈血栓栓塞癥(VTE)的病理生理過程。有不少學者報道左下肢更易發(fā)生DVT，因此本實驗選取大鼠左股靜脈作為建模血管[12-13]。

圖1 各組大鼠局部股靜脈的組織形態(tài)學觀察(蘇木素-伊紅染色，×100)

19世紀中期，國外學者Virchow提出血流緩慢、靜脈血管內皮損傷或功能不全、血液高凝狀態(tài)等三大與靜脈血栓形成密切相關的基本要素，在此基礎上進一步探討得出靜脈血栓是多種復雜原因及高危因素共同作用的結果。當前，DVT動物模型的制備主要以阻斷靜脈回流、造成血液淤滯誘發(fā)血栓形成為主，注入促凝物質或(和)機械性損傷血管內皮細胞為輔。雖然目前已有的建模方法各有特點，但均與臨床實際不盡相符，如：①臨床DVT絕大部分為亞急性或慢性，而現(xiàn)有建模方法所形成的血栓均為急性；②現(xiàn)有建模方法多為完全結扎靜脈以阻斷靜脈回流、造成血液淤滯而誘發(fā)血栓形成，這樣雖然可以形成穩(wěn)定的血栓，但是不能保障血栓的近心端通暢，不適合作為對溶栓及抗血栓藥物動態(tài)研究的模型，也不符合人體靜脈血栓的發(fā)病特點(臨床絕大多數(shù)DVT發(fā)病初始并不存在靜脈回流完全阻斷)；③電流損傷法、機械損傷法等均直接損傷靜脈，與臨床DVT幾乎都未直接損傷深靜脈不相符，且創(chuàng)傷性均較大，易引起全身應激狀態(tài)而對實驗模型造成干擾，不符合自然狀態(tài)下的深靜脈血栓形成過程；④注入促凝物質法與臨床DVT患者多無使用促凝血藥史不相符，且部分患者在使用抗凝血藥時仍發(fā)生DVT。因此，有必要探索新的建模方法以制備出更符合臨床的DVT動物模型。

本試驗通過部分結扎不完全阻滯左股靜脈血流(環(huán)形縮窄左股靜脈管腔約1/2限流)、不完全阻滯左股靜脈血流+左下肢制動、不完全阻滯左股靜脈血流+注入10%高滲鹽水1 ml、不完全阻滯左股靜脈血流+注入凝血酶0.25 U等方法制備DVT大鼠模型，致力于篩選出一種更穩(wěn)定、更符合臨床的DVT動物模型。結果發(fā)現(xiàn)：①單純通過部分結扎不完全阻滯左股靜脈血流(V1組)造模的血栓形成率低，與對照組(N組)及假手術組(S組)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。這與目前多數(shù)研究結果一致，表明DVT是多種因素共同作用的結果。②不完全阻滯左股靜脈血流+左下肢制動(V2組)、不完全阻滯左股靜脈血流+注入凝血酶0.25 U(V4組)造模的血栓形成率雖然高于N、S組，但仍不夠穩(wěn)定。其中V4組靜脈血栓形成不穩(wěn)定的原因可能是大鼠股靜脈血流未被完全阻滯，導致凝血酶迅速被運送到全身，局部被稀釋所致。另外，本實驗發(fā)現(xiàn)V4組形成的血栓為凝血酶注射所致的急性混合性血栓，與臨床實際形成的血栓在性質和成分上有很大不同，不能很好的模擬臨床DVT的病理生理演變過程。③不完全阻滯左股靜脈血流+注入10%高滲鹽水損傷局部靜脈血管壁(V3組)造模的血栓形成率高，形成血栓穩(wěn)定可靠。與完全結扎的模型相比，此模型更符合人體DVT的病理生理學演變，且形成血栓的血管段近心端保持通暢，可有效地用于觀察藥物溶栓或抗栓塞作用的效果。與電流損傷法、機械損傷法等直接損傷靜脈的造模方法相比，注入高滲鹽水對靜脈損傷較小，更符合臨床DVT的發(fā)病特點。且光鏡觀察見V3組不同時間點形成的血栓與臨床實際形成的血栓在性質和成分上相似，能很好的模擬臨床DVT的病理生理演變過程。

綜上所述，通過不完全阻滯股靜脈血流+注入10%高滲鹽水的方法，可以建立穩(wěn)定的大鼠DVT疾病模型，與完全結扎的模型比較，此模型更符合人體DVT的病理生理學演變，更適用于DVT的基礎研究。

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