魏偉超 宮麗鴻 安 毅

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110000；2遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110000）

搜風(fēng)祛痰法對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊HO-1和TLR4表達的影響*

魏偉超1宮麗鴻2安 毅1

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110000；2遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110000）

目的 觀察搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化（AS）不穩(wěn)定斑塊動物模型的影響。方法 6～8周齡ApoE基因敲除小鼠制備AS不穩(wěn)定斑塊模型，分別給予阿托伐他汀以及不同劑量穩(wěn)斑湯干預(yù)1個月，正常組采用生理鹽水灌胃1個月。取小鼠主動脈組織HE染色進行病理學(xué)觀察，并采用免疫組化和RT-PCR技術(shù)檢測HO-1和TLR4的表達水平。結(jié)果 各組小鼠腹主動脈組織中HO-1的表達水平治療組明顯高于對照組（P＜0.01），各組小鼠腹主動脈組織中TLR4的表達水平治療組明顯低于對照組（P＜0.01）。結(jié)論 Apo E基因敲除小鼠 AS不穩(wěn)定斑塊的形成與炎癥因子密切相關(guān)，搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯可能通過調(diào)節(jié)HO-1和TLR4的表達而干預(yù)AS斑塊形成及破裂。

痰風(fēng)理論論治 ApoE基因敲除小鼠 AS 不穩(wěn)定斑塊 HO-1 TLR4

現(xiàn)今心血管疾病導(dǎo)致全球總死亡的比例從1/10上升到1/3。動脈粥樣硬化（AS）斑塊破裂是急性心腦血管事件的重要危險因子，炎癥能改變斑塊性質(zhì)，改變其穩(wěn)定性。近來發(fā)現(xiàn)，血紅素是一種強致氧化物，能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化反應(yīng)。血紅素氧合酶（HO）是血紅素降解的起始酶和限速酶，HO-1氧化分解血紅素產(chǎn)生內(nèi)源性一氧化碳（CO），膽綠素和游離鐵，具有強大的抗氧化作用。研究發(fā)現(xiàn)CO同NO功能相似，能激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，增加環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）的生成，舒張血管平滑?。?］，還能抑制單核細(xì)胞及血小板向內(nèi)皮的黏附聚集、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移［2］。TOLL樣受體4（TLR4）的過度表達可誘發(fā)炎性反應(yīng)，促進AS斑塊形成及破裂。搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方在臨床上廣泛用于AS的治療，效果顯著，然而其作用機理仍未闡明。本實驗以ApoE基因敲除小鼠為研究對象，通過高脂飼養(yǎng)造出AS不穩(wěn)定斑塊模型，并給搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯干預(yù)，研究斑塊中的HO-1、TLR4表達情況，以推測其在斑塊形成及破裂中的作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡Apo E基因缺陷鼠 （系C57BL/6 J，北京大學(xué)實驗動物中心美國Jackson實驗室引進并培育成功）70只，SPF級，體質(zhì)量18～20 g。

1.2 藥物 選用穩(wěn)斑湯，藥物組成：全蝎10 g，蜈蚣2條，地龍 15 g，陳皮 15 g，法半夏 15 g，白術(shù) 15 g，水蛭15 g。由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥局提供，加工制成含生藥2 g/mL的中藥濃縮液備用。

1.3 試劑和儀器 HO-1，TLR4一抗及相對應(yīng)二抗（北京博奧森生物科技有限公司）。SP試劑盒（北京博奧森生物科技有限公司）。DAB顯色試劑盒（北京博奧森生物科技有限公司）。兩步法RT-PCR試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

1.4 模型制備 高脂飼料（含0.15%膽固醇）喂養(yǎng)13周后，隨機處死4只，取主動脈根部，HE染色觀察AS硬化程度，確定造模成功。

1.5 分組及給藥 Apo E基因敲除小鼠60只隨機分為模型組、穩(wěn)斑湯低劑量組、穩(wěn)斑湯中劑量組、穩(wěn)斑湯高劑量組及西藥組，每組12只。根據(jù)成人每日用藥臨床推薦的常用劑量，按成人與小鼠的體質(zhì)量折算系數(shù)9.0折算成小鼠用量。穩(wěn)斑湯低劑量組 61.75 g/（kg·d），穩(wěn)斑湯中劑量組 123.5 g/（kg·d），穩(wěn)斑湯高劑量組247 g/（kg·d）， 西藥組予阿托伐他汀 0.27 g/（kg·d），模型組給予生理鹽水0.3 mL/d。按體質(zhì)量系數(shù)比折算成小鼠用量灌胃給藥，每日1次。各組干預(yù)時間為1周。另取正常C57BL/6 J小鼠12只正常飼料喂養(yǎng)13周，設(shè)為空白組。取材前夜禁食，經(jīng)小鼠眼眶靜脈叢采血，離心分離血清，-80℃凍存用作測定血清HO-1、TLR4水平。處死全部小鼠，無菌條件下取出心臟及主動脈，心臟10%甲醛固定，主動脈放在凍存管內(nèi)液氮驟冷保存。

1.6 觀察指標(biāo) （1）主動脈組織病理學(xué)觀察。每組隨機取5只小鼠，麻醉處死，無菌條件下在每只小鼠的主動脈根部取4個相同的切面。切面分別為：升主動脈近端橫截面，切面形態(tài)呈圓形；主動脈瓣附著部位，并有冠狀動脈開口；主動脈瓣起始橫截面；主動脈瓣完全出現(xiàn)并匯合在一起。取材后用生理鹽水沖洗，10%甲醛中性溶液固定。常規(guī)石蠟包埋，均勻間斷切片，厚5 μm。①HE染色：普通光鏡下觀察主動脈根部組織及斑塊的形態(tài)結(jié)構(gòu)。②Masson染色：普通光鏡下觀察各斑塊中纖維成分的分布。（2）用計算機彩色圖像處理系統(tǒng)測量血管內(nèi)膜厚度，斑塊面積，管腔面積，脂質(zhì)核心面積，斑塊中除膠原和纖維成分以外的斑塊面積，最小纖維帽厚度。①免疫組織化學(xué)檢測：采用SP法，常規(guī)滴加一抗，二抗，DAB顯色蘇木精復(fù)染，高倍視野下計數(shù)浸潤于內(nèi)膜的單核細(xì)胞數(shù)。以染色系數(shù)統(tǒng)計HO-1免疫組化染色結(jié)果。②實時定量RT-PCR檢測：先提取總RNA，然后取4 μL總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶及隨機引物等反應(yīng)物混合配成20 μL體系，42℃15 min，95℃，2 min反轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，分別對小鼠HO-1，TLR4的表達進行測定。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較用t檢驗，多組均數(shù)比較用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠形態(tài)學(xué)改變的比較 各組小鼠腹主動脈HE染色形態(tài)學(xué)改變見圖1。空白對照組：動脈內(nèi)膜附有一層內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞層呈現(xiàn)皺褶狀排列，但排列均勻，表面光滑，未見泡沫細(xì)胞及炎性細(xì)胞。模型對照組：血管腔內(nèi)可見明顯的粥樣硬化斑塊出現(xiàn)，斑塊表面附有纖維帽，纖維帽主要由平滑肌細(xì)胞、彈力纖維和膠原組織構(gòu)成，斑塊中央可見大量的脂質(zhì)聚集，斑塊內(nèi)可見大量泡沫細(xì)胞，偶見炎性細(xì)胞浸潤；未出現(xiàn)斑塊的動脈內(nèi)膜區(qū)域嚴(yán)重破損。穩(wěn)斑湯低劑量組：血管腔內(nèi)可見粥樣硬化斑塊，斑塊面積明顯小于模型對照組，斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量較模型組少，斑塊內(nèi)可見少量泡沫細(xì)胞及炎性細(xì)胞；未出現(xiàn)斑塊的動脈內(nèi)膜區(qū)域形態(tài)較為完整，偶見內(nèi)膜殘缺。穩(wěn)斑湯中劑量組、穩(wěn)斑湯高劑量、西藥組：動脈內(nèi)膜大部分較為光滑，偶見內(nèi)膜不全，內(nèi)膜不全區(qū)域可見明顯的脂質(zhì)條紋塊形成，偶見泡沫細(xì)胞聚集，有少量纖維成分交聯(lián)。2.2 各組小鼠HO-1表達水平比較 各組小鼠腹主動脈組織中HO-1表達主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞 （EC）、泡沫細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）內(nèi)，以含棕褐色顆粒的細(xì)胞為HO-1蛋白表達的陽性細(xì)胞，見圖2?？瞻讓φ战M陽性細(xì)胞主要分布于內(nèi)膜，HO-1蛋白表達在EC內(nèi)；模型組HO-1蛋白表達明顯降低，偶見弱陽性表達；穩(wěn)斑湯低、中、高劑量組及西藥組表達水平顯著升高，廣泛表達于EC、VSMC及斑塊的泡沫細(xì)胞內(nèi)。

圖1 光鏡下各組小鼠腹主動脈根部組織及斑塊的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變（HE染色，100倍）

圖2 各組小鼠復(fù)制動脈組織中HO-1表達（免疫組化，DAB顯色，400倍）

各組小鼠腹主動脈組織中HO-1表達水平見表1、表2和圖3。Apo E-小鼠的免疫組化結(jié)果表明，搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯和阿托伐他汀均能提高斑塊內(nèi)HO-1的陽性表達（P＜0.01）。

表1 各組小鼠腹主動脈組織中HO-1蛋白表達水平（±s）

表1 各組小鼠腹主動脈組織中HO-1蛋白表達水平（±s）

與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

組 別 n空白對照組 5模型對照組 5穩(wěn)斑湯低劑量組 5 HO-1蛋白0.265±0.009 0.199±0.011**0.283±0.009**△△穩(wěn)斑湯中劑量組 5 0.310±0.010**△△穩(wěn)斑湯高劑量組 5 0.317±0.012**△△西藥組 5 0.315±0.008**△△

2.3 各組小鼠TLR-4表達水平比較 見表3，圖4。Apo E-小鼠的RT-PCR結(jié)果表明，搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯和阿托伐他汀均能降低各組小鼠腹主動脈組織中TLR-4 mRNA表達水平（P＜0.01）。

表2 各組小鼠腹主動脈組織中HO-1 mRNA表達水平（±s）

表2 各組小鼠腹主動脈組織中HO-1 mRNA表達水平（±s）

組 別 n空白對照組 5模型對照組 5穩(wěn)斑湯低劑量組 5 HO-1 mRNA 0.270±0.024 0.227±0.022*0.290±0.037△△穩(wěn)斑湯中劑量組 5 0.318±0.029*△△穩(wěn)斑湯高劑量組 5 0.367±0.041**△△西藥組 5 0.385±0.033**△△

圖3 各組小鼠腹主動脈組織中HO-1 mRNA表達電泳圖

表3 各組小鼠腹主動脈組織中TLR-4 mRNA表達水平（±s）

表3 各組小鼠腹主動脈組織中TLR-4 mRNA表達水平（±s）

組 別 n空白對照組 5模型對照組 5穩(wěn)斑湯低劑量組 5 TLR-4 mRNA 0.280±0.026 0.323±0.020**0.270±0.026△穩(wěn)斑湯中劑量組 5 0.243±0.013*△穩(wěn)斑湯高劑量組 5 0.209±0.021**△△西藥組 5 0.213±0.020**△△

圖4 各組小鼠腹主動脈組織中TLR4-1 mRNA表達電泳圖

3 討 論

Apo E基因缺陷小鼠在普通飼料飼養(yǎng)條件下能自發(fā)形成高脂血癥和動脈粥樣硬化，其動脈粥樣硬化發(fā)展包括脂質(zhì)條紋到有纖維帽覆蓋的成熟斑塊等各個階段，與人類AS斑塊類似，因而是目前研究AS斑塊較為理想的動物模型［3］。局部炎癥細(xì)胞的浸潤以及全身性炎癥是導(dǎo)致易損斑塊潰瘍、破裂導(dǎo)致血栓形成，是臨床AS發(fā)病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)［4］。大量研究認(rèn)為易損斑塊主要具有以下特點：巨大的脂質(zhì)中心，局部的慢性炎癥反應(yīng)，巨噬細(xì)胞增多、活化，破損部位T淋巴細(xì)胞聚集，平滑肌細(xì)胞數(shù)量減少以及纖維帽薄弱，膠原成分減少［5］。本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)高脂飲食喂養(yǎng)26周后，主動脈根部AS斑塊呈現(xiàn)易損斑塊的病理形態(tài)學(xué)特征。AS是一個復(fù)雜的病理進展過程，其發(fā)病機制至今尚未完全明了，其與內(nèi)皮細(xì)胞受損、平滑肌細(xì)胞增殖、炎癥細(xì)胞浸潤等因素密切相關(guān)［6-7］。近年研究表明動管腔阻塞不是由于斑塊無限制增長，而是由于斑塊破裂和血栓形成這一急性事件所致。HO是血紅素降解的起始酶和限速酶［8］。HO-1為誘導(dǎo)型HO，是其中最重要的一種酶，具有強大的抗炎及調(diào)節(jié)免疫作用，對心血管系統(tǒng)有保護作用。此外，HO-1氧化分解血紅素產(chǎn)生內(nèi)源性一氧化碳（CO），具有很強的抗氧化作用，可舒張血管平滑肌，參與循環(huán)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，并有抑制單核細(xì)胞及血小板向內(nèi)皮的黏附聚集、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移等方面的作用［9］。TLR主要存在于免疫系統(tǒng)，在細(xì)胞活化信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號中起重要作用，能辨別不同類型病原體并激活快速的自身免疫反應(yīng)；近年來發(fā)現(xiàn)在心血管系統(tǒng)中也有廣泛表達［10］。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4的識別功能可激活NF-κB進而導(dǎo)致一系列炎癥細(xì)胞因子的合成與釋放誘發(fā)炎癥反應(yīng)。TLR4促進oxLDL介導(dǎo)動脈粥樣硬化，充當(dāng)細(xì)菌感染與動脈粥樣硬化形成的一個橋梁［11］，與內(nèi)皮細(xì)胞功能受損促進動脈粥樣硬化形成有關(guān)［12］，總之TLR4與動脈硬化的形成、進展、斑塊不穩(wěn)定乃至破裂密切相關(guān)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為胸痹總屬陽微陰弦，氣虛推動無力，水液聚而生痰濕，痰為陰邪，易阻氣機而致瘀；痰濕日久易化熱，痰、瘀、熱三者相互促生，交結(jié)為患，日久不化，釀成濁脂，浸于脈管。《醫(yī)學(xué)心悟》曰“其人臟腑素有郁熱，則風(fēng)乘火勢，火借風(fēng)威，熱風(fēng)悱郁不得宣泄，而為熱風(fēng)矣”。熱風(fēng)既成，熱則灼血成瘀，煉液成痰，風(fēng)則引邪肆虐，流竄臟腑?！稏|醫(yī)寶鑒》也指出“痰者，津液因熱而成，熱則津液熏蒸而為胸痹心痛”。

本實驗選用復(fù)方穩(wěn)斑湯，方中全蝎、蜈蚣息風(fēng)止痙、解毒散結(jié)，蜈蚣兼能通絡(luò)止痛；地龍清熱息風(fēng)、平喘通絡(luò)止痙，共為君藥。陳皮、半夏、白術(shù)合用，既能燥濕化痰又可寬胸理氣、消痞散結(jié)，為臣藥；水蛭為蟲類活血藥、破血逐瘀，為佐藥。合方共奏搜風(fēng)祛瘀通絡(luò)之功效。風(fēng)為百病之長，其性善行而數(shù)變；痰為百病之祟。風(fēng)藥善于宣暢氣機疏通血絡(luò)，消除瘀滯，尤其蟲類風(fēng)藥更以行走攻竄見長，善疏通經(jīng)絡(luò)壅滯，開啟孔竅閉塞，故能通利心絡(luò)，開通心竅，善止痹痛。本研究結(jié)果表明搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯能有效干預(yù)動脈粥樣硬化斑塊的形成及破裂，其可能通過調(diào)節(jié)HO-1和TLR4的表達發(fā)揮作用。

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Study of Soufengqutan Method on Expression of Unstable Plaque HO-1 and TLR4 in ApoE Gene Knockout Rats with Atherosclerosis

WEI Weichao1，GONG Lihong2，AN Yi1.1Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning，Shenyang110000，China；2Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning，Shenyang110000，China

Objective:To observe the effect ofCompound Soufengqutanwenban Decoctionon unstable plaque in ApoE gene knockout rats with atherosclerosis.Methods:6 to 8 weeks old ApoE gene-deficient rats were selected to establish AS unstable plaque model，and then they were given low dose，medium-dose，high-dose Chinese herbal compound and western medicine for a month.At the same time，the model group was fed by normal saline for one month.Then aortic tissue was observed under optical microscope pathology after HE staining.And then levels of HO-1 and TLR4 were detected by immunohistochemistry and RT-PCR technique.Results:HO-1 expression levels in aortic tissue of rats in treatment groups was significantly higher than those in control group （P＜0.01）.TLR4 expression level of abdominal aortic tissue in treatment groups were significantly lower than those in control group （P＜0.01）.Conclusion:Unstable plaque formation of ApoE gene knockout rats with AS is closely related to inflammatory cytokines.Compound Soufengqutanwenban Decoctionmay stabilize plaques by regulating the expression of inflammatory factors and interfering the formation and rupture of AS plaque，which provides a new idea to prevent AS.

Phlegm-wind theory treatment；ApoE gene knockout rats；AS；Unstable plaque；HO-1；TLR4

R285.5

A

1004-745X（2014）07-1218-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.07.004

中國博士后科學(xué)基金資助項目（20110491540）

2014-04-01）