齊 鵬,張永旺

(天津中醫(yī)藥研究院 附屬醫(yī)院,天津 300120)

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津 LC-6A 高效液相色譜儀(LC-6A輸液泵，SPD-10A紫外檢測器，Anastar色譜工作站)；色譜分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，天津色譜科學技術公司)；電子分析天平(BP211D,Sartorius)；KQ2200 超聲波清洗器(昆明市超聲波儀器廠)；液體快速混合器(江西醫(yī)療器械廠)，離心機。

1.2 試藥

硫酸長春新堿對照品(VCR)(中國藥品生物制品檢定所，批號：20061211)；甲醇：色譜純(天津市彪仕奇科技發(fā)展有限公司，批號：06112802)；磷酸二氫鉀：分析純(天津市標準科技有限公司，批號：20050510)；乙腈：色譜純(天津市彪仕奇科技發(fā)展有限公司，批號：07011201)；其他試劑均為分析純。實驗用水為超純水。腫瘤組織樣品為新鮮、經低溫速凍的荷瘤裸鼠眼眶腺樣囊性癌細胞，由天津醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院提供。

2 試驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil-C18柱(250 mm×Φ4.6 mm，5 μm)；流動相：0.02 mol/L KH2PO4水溶液(三乙胺調pH=7.0):CH3OH(28∶72,V/V)；檢測波長：298 nm；柱溫：室溫；靈敏度：0.002AUFS；流速：0.8 mL/min；進樣量：20 μL。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取硫酸長春新堿對照品10 mg，置于100 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻 ；精密量取500 μL, 置于10 mL量瓶中,用流動相稀釋并定容，搖勻，即得5 μg/mL的VCR對照品溶液儲備液。

2.3 供試品溶液制備

取一定量腫瘤組織樣品，于2.5 mL硬質試管中，搗碎。加稀硫酸(pH=3)200 μL，混勻3 min，再加200 μL乙腈混勻，高速離心(13 000 r/min)4 min，取上清液，即得。

2.4 陰性對照溶液制備

取一定量空白組織樣品，按照供試品溶液的制備方法進行，即得陰性對照溶液。

3 實驗結果

3.1 系統(tǒng)適用性試驗

按2.1項下色譜條件,分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液10 μL 進樣。在此條件下硫酸長春新堿理論板數(shù)大于3 000 ;硫酸長春新堿與其成分能有效分離;供試品中的其他成分對測定成分無干擾(見圖1, 2, 3) 。

A 硫酸長春新堿

圖2 空白組織樣品色譜圖

A 硫酸長春新堿

3.2 線性實驗

精密量取儲備液50、100、150、250、500、1000 μL、2000 μL，置10 mL量瓶中，加流動相至刻度，分別得到濃度為0.025、0.05、0.075、0.125、0.25 、0.5、1 μg/mL標準液。按2.1項下分別進樣20 μL, 以濃度(μg/mL) 為橫坐標、峰面積為縱坐標,求得回歸方程為:Y=65 014X+ 2 130.6，r=0.9 999。線性范圍為(0.025～1)μg/mL。結果表明，硫酸長春新堿濃度在(0.025～1)μg/m)范圍內與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系。

3.3 精密度試驗

分別取0.125 μg/mL的對照品容液，連續(xù)進樣6次，每次20 μL，測得峰面積，RSD為2.71%。

3.4 穩(wěn)定性試驗

取線性范圍內的同一供試品溶液, 分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣20 μL , 測得峰面積,RSD為3.31%。表明樣品溶液在24 h內是穩(wěn)定的。

3.5 重復性試驗

取同一批樣品，按照供試品溶液的制備方法，按照2.1項下的色譜條件連續(xù)測定6次，，結果長春新堿的含量RSD為2.6%。

3.6 回收率試驗

取9份空白腫瘤組織，于2.5 mL硬質試管中，搗碎。分別加0.05 μg/mL的對照品液100 μL，0.125 μg/mL的對照品液100 μL，1 μg/mL的對照品液100 μL，漩渦震蕩5 min混勻。混勻后，每份加稀硫酸(pH=3)100 μL，混勻3 min，再加200 μL乙腈混勻，高速離心(13 000 r/min)4 min。每個水平平行做三個平行樣。計算平均回收率為98.28%。RSD為2.43%。結果見表1。

3.7 樣品含量測定

按2.3項下方法制備供試品溶液,照2.1 項下色譜條件測定,用外標法計算含量。數(shù)據(jù)可看出局部注射給藥后第1、3、5、7(第二次給藥前)、11、14 d，兩次給藥后的荷瘤裸鼠腺樣囊性癌細胞中的VCR含量變化，結果見表2。

表1 加樣回收率試驗測定結果(n=3)

表2 腫瘤組織中VCR的含量(n=6)

4 討論

4.1 流動相pH值的選擇[1]

流動相偏酸性時，出峰時間太早，影響分離，流動相不調pH值，長春新堿的色譜峰有拖尾現(xiàn)象，為調整出峰時間、改善峰形，用三乙胺調節(jié)流動相的pH值，發(fā)現(xiàn)pH=7時，峰形較好。

4.2 參考相關文獻

腫瘤組織樣品的處理方法用二氯甲烷提取，經過實際的實驗摸索，此方法提取回收量太低。曾經試用氯仿、乙酸乙酯-異丙醇(8∶2)、將組織先酸化，加乙醚除雜，將酸液層加堿中和，再用乙醚提取等方法，但經試驗效果并不理想，提取回收的率太低。將組織酸化后直接進樣[2]，濃度太低，而且雜峰較多。最終，我們實驗采用將組織酸化后用乙腈沉淀蛋白，離心，取清夜吹干，復溶后進樣。

HPLC法操作簡便, 分離度好, 準確度高, 重現(xiàn)性好, 回收率高, 可作為組織中硫酸長春新堿含量的測定方法，為臨床研究提供可靠的數(shù)據(jù)參考，為長春新堿新劑型的含量測定提供可行的方法學依據(jù)。

參考文獻：

[1] 孫勇，吳曉漁.反相高效液相色譜法測定硫酸長春新堿的含量[J]． 中國藥房，1999，10(6)：274—275．

[2] 國家藥典委員會．中國藥典2005年版(二部)[M]．北京：化學工業(yè)出版社，2005：721-722.