，， ，,2

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,浙江 杭州 310014;2.浙江工業(yè)大學(xué) 綠色化學(xué)合成技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,浙江 杭州 310014)

眾所周知，血清蛋白是一種最豐富的載體蛋白，對(duì)許多藥物和代謝物具有較強(qiáng)的親和力.通常，血清蛋白與藥物間相互作用越強(qiáng)，血液中游離藥物濃度越低；而弱相互作用導(dǎo)致藥物在體內(nèi)分布較差.因而，血清蛋白在藥物的傳輸、分布和代謝過程中起著重要作用[1].研究藥物與血清蛋白相互作用對(duì)理解藥物作用機(jī)制和代謝過程、改造藥物結(jié)構(gòu)和開發(fā)新藥是十分有用的[2-3]，已成為生命科學(xué)、化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一.牛血清蛋白(BSA)是由583個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成三個(gè)結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域都由兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(A和B)構(gòu)成.它與人血清蛋白(HSA)有著極為相似的結(jié)構(gòu)序，因此BSA已廣泛用于小分子化合物與血清蛋白相互作用的研究[4-9].

洛伐他汀(Lovastain)是一種3-羥基-3-甲戊二酰輔酶A還原酶抑制劑[10-11]，主要用于血脂異常的治療和心血管疾病的預(yù)防，也具有誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡[12]和降低乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[13]的潛力.至今，有關(guān)洛伐他汀與血清蛋白相互作用的研究國(guó)內(nèi)外尚未見公開報(bào)道，開展血清蛋白與洛伐他汀相互作用研究，對(duì)進(jìn)一步闡述其藥代和藥理作用具有重要意義.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

F96S熒光儀(上海棱光技術(shù)有限公司);J-815圓二色譜儀(日本JASCO公司)；UV-1601紫外-可見分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司)；DK-S24電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；雷磁pHS-25型數(shù)顯pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司).Chem3D (Version 8.0)軟件(美國(guó)CambridgeSoft公司)；Gaussian 03軟件(美國(guó)Gaussian公司)；AutoDock 4.0軟件來自于SWISS-MODEL Repository (http://swissmodel.expasy.org/repository/?pid=smr01&zid=async).

洛伐他汀(≥99.9%)由杭州默沙東公司(杭州,中國(guó))提供；BSA購于上海申航生物科技有限公司(上海,中國(guó))；保泰松(≥99.9%)購于湖北恒碩化工有限公司(湖北,中國(guó))；布洛芬(≥99.9%)由浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院提供.三(羥基甲基)氨基甲烷(≥99%)購于衢化試劑有限公司(浙江,中國(guó)).

其他所用試劑均為分析純，整個(gè)實(shí)驗(yàn)所用水為二次重蒸水.

1.2 溶液配制

洛伐他汀溶液：準(zhǔn)確稱量0.101 1 g洛伐他汀用甲醇定容于25 mL的容量瓶中，然后準(zhǔn)確移取0.5 mL甲醇溶液到100 mL容量瓶，用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=7.4)定容，配制成5×10-5mol/L溶液作為儲(chǔ)備液.此溶液保存溫度4 ℃以下.

BSA溶液：稱取0.730 5 g氯化鈉和0.166 1 g牛血清蛋白，置于250 mL容量瓶中，用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.4)定容，配制成10-5mol/L BSA-NaCl儲(chǔ)備液.此溶液保存于4 ℃以下.

保泰松溶液：準(zhǔn)確稱量0.077 1 g保泰松用甲醇定容于25 mL的容量瓶中，然后準(zhǔn)確移取0.5 mL甲醇溶液到100 mL容量瓶，用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.4)定容，配制成5×10-5mol/L溶液作為儲(chǔ)備液.

布洛芬溶液：準(zhǔn)確稱量0.051 6 g布洛芬用甲醇定容于25 mL的容量瓶中，然后精密移取0.5 mL甲醇溶液到100 mL容量瓶，用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.4)定容，配制成5×10-5mol/L溶液作為儲(chǔ)備液.

1.3 熒光光譜測(cè)定

配制一系列含有不同洛伐他汀濃度的BSA溶液，含BSA濃度為1.0×10-6mol/L，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為289 nm，在不同溫度下測(cè)定其熒光光譜，掃描范圍300～450 nm.測(cè)定時(shí)，以0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液進(jìn)行熒光空白校正.

1.4 紫外光譜測(cè)定

在室溫下，以0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液為參比溶液，測(cè)定BSA和洛伐他汀溶液的紫外光譜，掃描范圍200～400 nm.

1.5 圓二色譜測(cè)定

在室溫下，以0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液為參比溶液，測(cè)定BSA和洛伐他汀溶液的圓二色譜，掃描范圍200～240 nm.

1.6 分子對(duì)接模擬

BSA晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(P02769)從Protein Data Bank (http://www.pdb.org/pdb/home/home.do)獲取.洛伐他汀3D結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)從PubChem數(shù)據(jù)庫(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲取，其結(jié)構(gòu)運(yùn)用DFT理論在B3lyp/6-311+G(d)水平上進(jìn)行最低能量?jī)?yōu)化至Hessian矩陣分析無虛頻，其理論計(jì)算在Gaussian 03軟件上完成.

洛伐他汀與BSA之間的相互作用運(yùn)用AutoDock 4.0軟件模擬.模擬計(jì)算時(shí)，網(wǎng)格大小設(shè)置為60(60(60，網(wǎng)格中心分別設(shè)置為(6.113 4,-11.009 6,7.119 7),points(6.841 1,2.435 6,-14.718 4) and points (-1.216,-20.239,-6.738).采用拉馬克遺傳算法(Lamarckian GA)，進(jìn)行200次運(yùn)算，其他參數(shù)均設(shè)置為程序的默認(rèn)值.

2 結(jié)果與討論

2.1 BSA熒光猝滅

蛋白質(zhì)具有天然熒光，這種吸收主要是來自與蛋白分子中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基.含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的蛋白質(zhì)，最大熒光發(fā)射約在320～350 nm范圍內(nèi).三種氨基酸中，色氨酸的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，對(duì)微環(huán)境的變化最為敏感，所以研究溶液中蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化時(shí)，常將其作為蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光探針[14-15].從圖1可知：隨著洛伐他汀濃度的增加，BSA的熒光強(qiáng)度逐漸降低；而最大發(fā)射波長(zhǎng)未發(fā)生變化.這表明了洛伐他汀與BSA發(fā)生了相互作用，從而導(dǎo)致BSA熒光猝滅.其猝滅常數(shù)可用Stern-Volmer方程計(jì)算[16],即

(1)

式中：F0為無猝滅劑洛伐他汀存在時(shí)BSA溶液的熒光發(fā)射強(qiáng)度；F為猝滅劑洛伐他汀存在時(shí)BSA溶液的熒光發(fā)射強(qiáng)度；[Q]為猝滅劑洛伐他汀總濃度；kq為生物分子猝滅速率常數(shù)；KSV為猝滅速率常數(shù)；τ0≈6ns[17]為無猝滅劑存在時(shí)BSA的平均熒光壽命.

從曲線0—5，CLovastatin=0,5×10-6,10×10-6, 15×10-6,20×10-6和25×10-6 mol/L

從圖2可見：F0/F與洛伐他汀濃度之間具有良好的線性關(guān)系，由其斜率可求得不同溫度下的猝滅常數(shù)(KSV).一般認(rèn)為，對(duì)由于形成基態(tài)結(jié)合物的靜態(tài)猝滅，其KSV隨溫度升高而減小；而由擴(kuò)散碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅，KSV隨溫度升高而增大.另外，動(dòng)態(tài)猝滅過程中，其猝滅速率常數(shù)(kq)小于2×1010L/(mol·s)[18].從表1可知：洛伐他汀誘導(dǎo)的BSA熒光猝滅常數(shù)隨溫度升高而減小，并且猝滅速率常數(shù)(kq)大于2×1010L/(mol·s).這表明了洛伐他汀誘導(dǎo)的BSA熒光猝滅是一個(gè)靜態(tài)猝滅過程，則洛伐他汀與BSA相互作用形成了結(jié)合物.

圖2 不同溫度下洛伐他汀猝滅BSA的Sterm-Volmer圖

表1 不同溫度下洛伐他汀猝滅BSA的猝滅常數(shù)

2.2 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)的測(cè)定

對(duì)于靜態(tài)猝滅，假設(shè)蛋白分子對(duì)配體分子有n個(gè)等同且獨(dú)立的結(jié)合部位，其可結(jié)合常數(shù)(Kb)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)可根據(jù)方程計(jì)算[16]，即

lg[(F0-F)/F]=lgKb+nlg[Q]

(2)

因此，從圖3的線性回歸方程可得洛伐他汀與BSA的結(jié)合常數(shù)(Kb)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)，其結(jié)果如表3所示.從表3可知:在實(shí)驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，BSA與洛伐他汀的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)接近1，表明了洛伐他汀與BSA相互作用形成1∶1結(jié)合物，且結(jié)合常數(shù)為7.11×103L/mol (298 K).

圖3 不同溫度下洛伐他汀對(duì)BSA熒光猝滅的雙對(duì)數(shù)曲線

表2 洛伐他汀結(jié)合到BSA上的熱力學(xué)參數(shù)和結(jié)合常數(shù)(Kb)

2.3 熱力學(xué)參數(shù)和結(jié)合模式

配體與蛋白相互作用過程中的主要非共價(jià)作用力有：氫鍵、范德華力、疏水作用及靜電作用四種.配體與蛋白相互作用過程中的熱力學(xué)參數(shù)的大小和正負(fù)，常用于判斷配體與蛋白的作用模式.一般認(rèn)為，ΔH0>0和ΔS0>0時(shí)，為典型的疏水作用；ΔH0<0和ΔS0<0時(shí)，分子間作用力為氫鍵作用和范德華力；ΔH0<0和ΔS0>0時(shí)，同時(shí)存在疏水作用和氫鍵作用；ΔH0≈0或較小、ΔS0>0時(shí)，主要作用力為靜電作用[19].當(dāng)溫度變化不大時(shí)，蛋白與藥物結(jié)合過程中的焓變(ΔH0)、熵變(ΔS0)及吉布斯自由能(ΔG0)可由Van’t Hoff方程測(cè)定[8]，即

ΔG0=-RTlnKb

(3)

(4)

式中R為氣體常數(shù).結(jié)果表明：lnKb與1/T之間具有良好線性關(guān)系，其熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算結(jié)果列于表2.BSA與洛伐他汀作用過程中的ΔH0和ΔS0分別為-18.126 kJ/mol和12.84 J/(mol·K)(表2)，表明了BSA與洛伐他汀相互作用的主要作用力是疏水作用和氫鍵作用.

2.4 圓二色譜和紫外光譜的測(cè)定

圓二色譜(CD)是一種常用于鑒定蛋白與配體相互作用過程中蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的方法.當(dāng)洛伐他汀存在時(shí)BSA的CD譜如圖4所示.從圖4可知：游離BSA溶液存在兩個(gè)負(fù)吸收帶，分別位于209 nm和222 nm.這是BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的特征峰，它歸屬于α-螺旋肽鍵的π→π*和n→π* 電子躍遷.當(dāng)洛伐他汀加入到BSA溶液后，BSA的CD譜的負(fù)峰強(qiáng)度略有增強(qiáng).這表明了洛伐他汀與BSA結(jié)合后，導(dǎo)致BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，且其α-螺旋量略有增加.

1-游離BSA溶液(1.0×106 mol/L);2-游離洛伐他汀溶液(25×106 mol/L);3-洛伐他汀(25×106 mol/L)和BSA(1.0×106 mol/L)混合溶液;4-曲線3與曲線2的差譜

從圖5可知：洛伐他汀和BSA混合溶液與游離洛伐他汀的差譜與游離BSA光譜存在著一定變化，其吸光度略有增加，并且其吸收波長(zhǎng)紅移.這意味著BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了微小變化.

1-游離洛伐他汀(25×106 mol/L);2-游離BSA溶液(0.5×106 mol/L);3-洛伐他汀(25×106 mol/L)和BSA(0.5×106 mol/L)混合溶液;4-曲線3與曲線1的差譜

2.5 結(jié)合位點(diǎn)的確定

許多研究結(jié)果表明配體在BSA上的結(jié)合位點(diǎn)主要有亞結(jié)構(gòu)域IIA(site I)和亞結(jié)構(gòu)域IIIA(site II)位，而且保泰松、華法林結(jié)合在site I位上，布洛芬、氯滅酸結(jié)合在site II位[20].為了測(cè)定洛伐他汀在BSA上結(jié)合位點(diǎn)，保泰松和布洛芬分別用作site I和site II位的探針分子.在結(jié)合位點(diǎn)探針分子存在下，BSA(CBSA=1×10-6mol/L)溶液的熒光光譜如圖6所示.從圖6可知：隨著洛伐他汀加入到保泰松-BSA混合液中，BSA的熒光強(qiáng)度隨之下降，出現(xiàn)熒光猝滅；而洛伐他汀加入布洛芬-BSA混合液中，其BSA的熒光強(qiáng)度基本不變.依據(jù)式(2)可計(jì)算出位點(diǎn)探針分子存在下，BSA與洛伐他汀的結(jié)合常數(shù)，如表3所示.從表3可見：當(dāng)保泰松位點(diǎn)探針分子存在時(shí)，BSA與洛伐他汀的結(jié)合常數(shù)變化較?。欢悸宸椅稽c(diǎn)探針分子存在時(shí)，BSA與洛伐他汀的結(jié)合常數(shù)接近0.這表明了布洛芬與洛伐他汀與BSA之間發(fā)生了明顯競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，意味著洛伐他汀主要結(jié)合在BSA的site II上.

曲線0—5洛伐他汀濃度：0,5×10-6,10×10-6,15×10-6,20×10-6,25×10-6 mol/L

表3 在位點(diǎn)探針分子存在下BSA與洛伐他汀的結(jié)合常數(shù)

2.6 分子對(duì)接

為了進(jìn)一步闡明洛伐他汀與BSA的結(jié)合位點(diǎn)和相互作用力，依據(jù)保泰松和布洛芬在HSA上的結(jié)合位點(diǎn)，用AutoDock 4.0進(jìn)行模擬洛伐他汀與BSA的相互作用，其結(jié)果列于表4.結(jié)合能越小，表明形成的結(jié)合物越穩(wěn)定.因此，洛伐他汀優(yōu)先結(jié)合在BSA的site II位上，如圖7(a)所示.這與探針分子競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的.從圖7(b)可知：洛伐他汀-BSA結(jié)合物中，距洛伐他汀5.000范圍內(nèi)氨基酸殘基有疏水性殘基(Ala-314,Leu-221,Leu-261,Leu-478,Pro-470)、極性殘基(Cys-471,Trp-237,Tyr-475,)和帶電荷殘基(Arg-218,Arg-222,Arg-241,Asp-474,Lys-245).另外，洛伐他汀與Arg-218和Arg-241殘基間形成穩(wěn)定氫鍵(圖7c)，并且ΔE3絕對(duì)值明顯小于ΔE2.這表明了洛伐他汀與BSA間的主要作用力是疏水作用力和氫鍵作用力，這與熱力學(xué)參數(shù)分析結(jié)果是一致的.

表4 分子對(duì)接獲到的洛伐他汀-BSA結(jié)合物的能量1)

圖7 洛伐他汀與BSA分子對(duì)接結(jié)果圖

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：洛伐他汀通過疏水作用和氫鍵作用插入BSA的亞結(jié)構(gòu)域IIIA(site II)疏水腔，導(dǎo)致BSA熒光穩(wěn)態(tài)猝滅.洛伐他汀與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均約為1，形成1∶1結(jié)合物，其結(jié)合常數(shù)(Kb)數(shù)量級(jí)為103.當(dāng)洛伐他汀結(jié)合到BSA亞結(jié)構(gòu)域IIIA(site II)后，導(dǎo)致BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生微小變化.兩者結(jié)合過程中，吉布斯自由能(ΔG0)、焓變(ΔH0)和熵變(ΔS0)分別為-21.94 kJ/mol，-18.13 kJ/mol和12.84 J/(mol·K)，表明洛伐他汀與BSA結(jié)合是一個(gè)自發(fā)的過程，其主要作用力是疏水作用和氫鍵作用.

參考文獻(xiàn)：

[1] GUO Ming, ZOU Jian-wei, YI Ping-gui, et al. Binding interaction of gatifloxacin with bovine serum albumin[J]. Analtical Sciences,2004,20(3):465-470.

[2] JAYABHARATHI J, THANIKACHALAM V, PERUMAL M V. A study on the binding interaction between the imidazole derivative and bovine serum albumin by fluorescence spectroscopy[J]. Journal of Luminescence,2012，132(3):707-712.

[3] GENG Fei, ZHANG Li-qiang, YU Li, et al. Interaction of bovine serum albumin and long-chain imidazolium ionic liquid measured by fluorescence spectra and surface tension[J]. Process Biochemistry,2010,45(3):306-311.

[4] GELAMO E L, SILVA C H T P, IMASATO H, et al. Interaction of bovine (BSA) and human (HSA) serum albumins with ionic surfactants: spectroscopy and modeling[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology,2002,1594(1):84-99.

[5] ZHANG Li-na, WU Fang-ying, LIU Ai-hong. Study of the interaction between 2,5-di-[2-(4-hydroxy-phenyl) ethylene]-terephthalonitril and bovine serum albumin by fluorescence spectroscopy[J]. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2011,79(1):97-103.

[6] SHAHABADI N, FILI S M. Molecular modeling and multispectroscopic studies of the interaction of mesalamine with bovine serum albumin[J]. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2014,118:422-429.

[7] YU Xian-yong, LIAO Zhi-xi, YAO Qing, et al. The investigation of the interaction between Tropicamide and bovine serum albumin by spectroscopic methods[J]. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2014,118:331-336.

[8] SHI Jie-hua, ZHU Ying-Yao, WANG Jing, et al. Intermolecular interaction of prednisolone with bovine serum albumin: Spectroscopic and molecular docking methods[J]. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2013,103:287-294.

[9] SHI Jie-hua, WANG Jing, ZHU Ying-yao, et al. Characterization of interaction between isoliquiritigenin and bovine serum albumin: Spectroscopic and molecular docking methods[J]. Journal of Luminescence,2014,145:643-650.

[10] ALBERTS A W. Discovery, biochemistry and biology of lovastatin[J]. American Journal of Cardiology,1998,62:J10-J15.

[11] 施介華,薛竹.微乳液相色譜法測(cè)定他汀類藥物[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,40(2):119-123.

[12] MARTIROSYAN A, CLENDENING J W, GOARD C A, et al. Lovastatin induces apoptosis of ovarian cancer cells and synergizes with doxorubicin: Potential therapeutic relevance[J]. BMC Cancer,2010,10:103.

[13] KLAWITTER J, SHOKATI T, MOLL V, et al. Effects of lovastatin on breast cancer cells: a proteo-metabonomic study[J]. Breast Cancer Research,2010,12:R16.

[14] SKRT M, BENEDIK E, PODLIPNIK, et al. Interactions of different polyphenols with bovine serum albumin using fluorescence quenching and molecular docking[J]. Food Chemistry,2012,135(4):2418-2424.

[15] JOSHI P, CHAKRABORTY S, DEY S, et al. Binding of chloroquine-conjugated gold nanoparticles with bovine serum albumin[J]. Journal of Colloid and Interface Science，2011,355(2):402-409.

[16] LAKOWICZ J R. Principles of fluorescence spectroscopy[M]. 3rd. New York: Springer,2006:278.

[17] WARE W R. Oxygen quenching of fluorescence in solution: an experimental study of the diffusion process [J].Journal of Physical Chemistry,1962,66(4):455-458.

[18] ABOU-ZIED O K, AL-SHIHI O I K. Characterization of subdomain IIA binding site of human serum albumin in its native, unfolded, and refolded states using small molecular probes[J]. Journal of the American Chemical Society,2008,130(32):10793-10801.

[19] LAKOWICZ J R, WEBER G. Quenching of fluorescence by oxygen: A probe for structural fluctuations in macromolecules[J]. Biochemistry,1973,12(21):4161-4170.

[20] SREERAMA N, WOODY R W. A self-consistent method for the analysis of protein secondary structure from circular dichroism[J]. Analytical Biochemistry,1993,209(1):32-44.