吳 丹

(江蘇省無(wú)錫市第二人民醫(yī)院 心內(nèi)科, 江蘇 無(wú)錫, 214002)

已有許多研究[1]提示了中樞內(nèi)血管緊張素Ⅱ?qū)π乃グl(fā)展可能的促進(jìn)作用。而SD大鼠腦片膜片鉗的研究，進(jìn)一步揭示了通過(guò)血管緊張素作用于AT1型受體進(jìn)而影響到下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞的興奮性的離子機(jī)制[2]。本實(shí)驗(yàn)探討PVN內(nèi)AT1-R的蛋白表達(dá)變化情況，以期進(jìn)一步證實(shí)中樞內(nèi)包括血管緊張素Ⅱ及AT1-R介導(dǎo)的對(duì)于心衰可能的促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Spreague-Dawley(SD)大鼠。體質(zhì)量(200±20) g。購(gòu)自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：2082871。

1.2 主要試劑

水合氯醛、α-氯醛糖、羊抗兔IgG FITC 熒光二抗、Triton X-100、多聚甲醛、Hoechst33342: Sigma、二抗(goat anti-rabbit IgG-HRP): Santa Cruz; 抗AT1-R一抗: abcam; Tris 三(羥甲基)氨基甲烷：上海生工、青霉素：華北制藥廠; RIPA裂解液、PMSF(100mM)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、BeyoECL Plus(超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒)、抗熒光淬滅封片液、彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、PVDF膜(進(jìn)口分裝)、Actin抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)：海門(mén)碧云天；無(wú)水乙醇、甲醇：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司、鹽酸：汕頭市西隴化工廠有限公司、氫氧化鈉：南京化學(xué)試劑有限公司；AP(過(guò)硫酸銨)、SDS(十二烷基磺酸鈉)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tween-20、L-甘氨酸、TEMED(N, N, N′,N′-四甲基二乙胺) ：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。

1.3 主要儀器

ALC-V8動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司)，VIVID-7 型彩色多普勒超聲診斷儀(美國(guó)GE公司)，JY10001型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，超低溫冰箱(日本SANYO), BCD-254型冰箱(德國(guó)SIEMENS)，Eppendorf5417R冷凍離心機(jī)(德國(guó))，101AB-2型電熱恒溫干燥箱(江蘇海門(mén)恒昌儀器廠)，DK-8A電熱恒溫水槽(上海華聯(lián)環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備公司恒昌儀器廠), Synergy-2多功能酶標(biāo)儀(Biotek)，CM-1900UV冷凍切片機(jī)(Leica), DM4000B研究級(jí)正置熒光顯微鏡(Leica)，基礎(chǔ)電泳儀(BioRad)，小型垂直電泳槽(BioRad)，小型轉(zhuǎn)膜槽(BioRad)，超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(ChemiDocXRS+)(BioRad)。

1.4 心衰大鼠模型制作與分組

將20只健康雄性清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為手術(shù)組10只與假手術(shù)組10只。用結(jié)扎大鼠冠脈左前降支(LAD)的方法構(gòu)建慢性心力衰竭大鼠模型。術(shù)后6周，2組大鼠采用VIVID-7 型彩色多普勒超聲診斷儀測(cè)量二維超聲心動(dòng)圖，對(duì)大鼠心臟進(jìn)行掃查。采用EF值<42%作為評(píng)定心力衰竭的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。所有大鼠術(shù)后6周即行處死、取材，備以下實(shí)驗(yàn)所用。Western Blot技術(shù)(隨機(jī)抽取5只心衰及5只假手術(shù)組)或免疫熒光技術(shù)的檢測(cè)(隨機(jī)抽取5只心衰及5只假手術(shù)組)。通過(guò) Western Blot技術(shù)檢測(cè)室旁核內(nèi)AT1-R的表達(dá)情況。大鼠斷頭，迅速取出腦，轉(zhuǎn)移至液氮中，隨后儲(chǔ)存在-70 ℃的條件下，迅速?gòu)谋渲腥〕霰鶅龅哪X，用冰凍切片機(jī)切片。切片厚度：300 m(60 m×5)。在冰上操作，用穿孔器，根據(jù)大鼠腦定位圖譜(Watson & Paxinos)，在1 mm厚(距前囟點(diǎn)-0.84 mm～-2.28 mm)的雙側(cè)腦片的PVN所在區(qū)域，打孔，提取PVN至Eppendorf管中。再進(jìn)行蛋白質(zhì)抽提、蛋白定量，配制10%的SDS-PAGE分離膠、配制5%的濃縮膠、灌膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉及加入抗體孵育、顯影、使用Quantity One軟件分別測(cè)定目的蛋白及相應(yīng)內(nèi)參條帶的面積和灰度值的乘積，進(jìn)而計(jì)算上述兩者面積和灰度值乘積的比值，來(lái)表示蛋白的表達(dá)水平。使用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)AT1-R的免疫組織化學(xué)表達(dá)情況。大鼠麻醉后行心臟多聚甲醛灌注，取腦后行冰凍切片，每只大鼠取20張PVN腦片，選取5個(gè)冠狀位切面觀測(cè)AT1-R陽(yáng)性神經(jīng)元分布情況，并作陰性對(duì)照。將腦片貼片后，用AT1-R的一抗保濕孵育，漂洗后，使用羊抗兔IgG-FITC(二抗)保濕避光孵育并漂洗。使用核染色劑Hoechst33342標(biāo)記細(xì)胞核。保濕避光孵育后漂洗。封片后使用熒光正置顯微鏡鏡檢。觀測(cè)5個(gè)冠狀位切面腦片上AT1-R陽(yáng)性神經(jīng)元的分布及數(shù)量，并作統(tǒng)計(jì)。用物鏡40倍分別拍片。每張腦片在物鏡40倍下，隨機(jī)取4個(gè)PVN視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量的總和，比較心衰與假手術(shù)組AT1-R三種蛋白之間的表達(dá)差異。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用兩獨(dú)立樣本均數(shù)的t-檢驗(yàn)來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

心衰組與假手術(shù)組心超測(cè)定的EF值比較，心衰組大鼠的左心室收縮期內(nèi)徑(LVIDs)、射血分?jǐn)?shù)(EF%)及短軸縮短率(FS%)較假手術(shù)組明顯降低。見(jiàn)表1。

表1 2組大鼠心超結(jié)果比較

與假手術(shù)組比較，*P<0.05。

Western Blot技術(shù)檢測(cè)室旁核內(nèi)AT1-R的表達(dá)情況顯示，心衰組室旁核內(nèi)的AT1-R表達(dá)明顯高于假手術(shù)組[(1.69±0.85)、(0.49±0.31),P<0.05], 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1、表2。

表2 2組Western Blot檢測(cè)室旁核內(nèi)AT1-R結(jié)果

免疫熒光技術(shù)檢測(cè)室旁核內(nèi)AT1-R的表達(dá)情況顯示，心衰組室旁核內(nèi)的AT1-R表達(dá)明顯高于假手術(shù)組[分別為(821.00±79.25)、(466.40±68.86)，P<0.05], 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2、表3。

表3 2組免疫熒光技術(shù)檢測(cè)室旁核內(nèi)AT1-R結(jié)果

3 討 論

作者采用Western blot 及免疫熒光的方法所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，心梗后心衰SD大鼠PVN中血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1-R)的蛋白表達(dá)及分布密度比假手術(shù)組明顯增加。與他人的研究結(jié)果，即心梗后AT1-R及血管緊縮素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的mRNA、蛋白表達(dá)水平在穹隆下器(SFO)、PVN等神經(jīng)核團(tuán)中明顯增加[3-4]相一致。提示血管緊張素Ⅱ通過(guò)中樞內(nèi)AT1-R介導(dǎo)的機(jī)制影響心衰的進(jìn)程。有研究[2,5-6]證實(shí)中樞血管緊張素Ⅱ可促進(jìn)心室重構(gòu)而加重心衰。上述通路可活化血管緊張素能通路并進(jìn)一步提高交感神經(jīng)活性，而促進(jìn)心衰的發(fā)展。由于血管緊張素Ⅱ可通過(guò)激活血管緊張素Ⅱ1型受體及介導(dǎo)多種陽(yáng)離子電流的離子通道，興奮支配延髓頭端腹外側(cè)(RVLM)的PVN神經(jīng)元[7], 因此作者推測(cè)中樞血管緊張素Ⅱ通過(guò)具有投射至腦干心血管調(diào)控中樞(延髓頭端腹外側(cè)核, RVLM)的纖維的PVN神經(jīng)元表達(dá)的AT1-R，來(lái)影響交感神經(jīng)沖動(dòng)外流進(jìn)而促進(jìn)心衰進(jìn)展。

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