汪 瑩，胡 冰，徐丹娜，馬慧麗，賴童飛，周 婷

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

葡萄(Vitisvinifera)是葡萄屬一種常見落葉木質(zhì)藤本植物，果實(shí)為漿果類水果.葡萄籽為葡萄的種子，質(zhì)量約占整粒葡萄的5%～7%，是葡萄酒廠和飲料廠在榨汁過程中的主要副產(chǎn)品.我國(guó)是葡萄生產(chǎn)大國(guó)，2012年產(chǎn)量達(dá)960萬噸(http://faostat.fao.org/)，可產(chǎn)生至少20～30萬噸的葡萄籽.葡萄籽含有豐富的蛋白質(zhì)、粗脂肪、各種氨基酸、維生素及礦物質(zhì)等[1]，具有一定的營(yíng)養(yǎng)及藥用價(jià)值.但國(guó)內(nèi)尚未對(duì)葡萄籽進(jìn)行良好的加工利用，分離后多丟棄或發(fā)酵后用做肥料，造成了資源的浪費(fèi).

目前，對(duì)于葡萄籽的開發(fā)主要集中于榨油(葡萄籽油中富含人體必需且自身不能合成的亞油酸)及提取其中的天然抗氧化成分低聚原花青素(Oligomeric proanthocyanidins, OPC).近年來，研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽及其衍生物具有更多的用途.Adámez等研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽提取物對(duì)格蘭仕陽性菌及陰性菌均有明顯的抑制作用[2]；Su等發(fā)現(xiàn)葡萄籽提取物能夠控制HAV、FCV-F9、MNV-1的3種食源性病毒引發(fā)的病害[3]；Afonso等研究表明葡萄籽中的酚類復(fù)合物能夠抑制Angiotensin I converting enzyme的活性，可用于治療心血管疾病[4]；同時(shí)，葡萄籽提取物對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[5]、鎘誘導(dǎo)的腎損傷[6]、膀胱癌[7]有一定的療效.此外，Reddy等將葡萄籽提取物用于羊肉切片及銀鯉的冷藏保鮮[8-9]；Okaman等還通過化學(xué)活化途徑將葡萄籽制成活性炭[10].但是長(zhǎng)期以來，對(duì)葡萄籽的重要組分蛋白質(zhì)(約占總重的8.44%～25.9%)關(guān)注度較低，早期主要集中于葡萄籽蛋白的分離提取技術(shù)[11-12]，近年來，Pesavento等利用MALDI-MS分析了不同栽培品種葡萄籽蛋白的區(qū)別，但沒有鑒定具體的成分[13]；Gazzola等利用LC-MS/MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)葡萄籽胚乳蛋白主要成分與植物種子蛋白11S globulin同源，并鑒定出一種分子量為43 kDa且與豆科種子7S globulins高度同源的蛋白[14].葡萄籽蛋白的營(yíng)養(yǎng)學(xué)價(jià)值及應(yīng)用潛力需要進(jìn)一步挖掘.

因此，本研究主要通過雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)、氨基酸含量分析以及紅外光譜分析技術(shù)，初步研究了葡萄籽蛋白的主要成分及生化特性，為葡萄籽的綜合利用和深度開發(fā)提供了理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

葡萄(VitisviniferaL.)籽分離自葡萄皮渣，干燥后用于后續(xù)試驗(yàn)，由天津尖峰天然產(chǎn)物研究發(fā)展有限公司提供.大豆分離蛋白(蛋白含量為85%)，購自哈爾濱大豆高新科技有限公司.

1.2 葡萄籽化學(xué)成分分析

葡萄籽的各項(xiàng)生化指標(biāo)檢測(cè)簡(jiǎn)述如下，水分的測(cè)定參見GB/T 5009.3-03：直接干燥法；灰分的測(cè)定參見GB/T 5009.4-03：干法灰化；脂肪的測(cè)定參見GB/T 5009.6-03：索氏抽提；蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參見GB/T 5009.5-03：微量凱氏定氮法.

使用IRIS Intrepid型電感耦合全譜直讀等離子發(fā)射光譜儀(Thermo，USA)，檢測(cè)葡萄籽金屬含量.準(zhǔn)確稱取葡萄籽粉末0.5 g，放入聚四氟乙烯消解罐中.消解罐中加入10 mL王水(V(HCl) ∶V(HNO3)=3∶1)，100 ℃加熱2 h，冷卻到室溫后向消解罐中加入3 mL HNO3，100 ℃加熱2 h，冷卻到室溫再加入1 mL HNO3，120 ℃加熱4 h，冷卻靜置過夜.用超純水定容至50 mL.ICP-AES法測(cè)定，射頻功率1 050 kW，霧化氣壓力為4.25×106Pa，輔助氣流速110 L/min，樣品提升量1 170 mL/min，樣品沖洗時(shí)間1 min，高波掃描5 s，低波掃描30 s.

1.3 葡萄籽蛋白提取及雙向電泳分析

將100 g葡萄籽粉碎、勻漿(50 mmol/L PBS +1%(w/v)PVP，pH 7.5，料液比例為1 g∶4 mL)，8層紗布過濾后，4 ℃、12 000 g、30 min離心保留上清液，超純水透析，100 kDa超濾膜濃縮，冷凍干燥，蛋白干粉樣品-80 ℃保存?zhèn)溆?

按10 μg∶1 μL比例將蛋白干粉溶解于蛋白裂解緩沖液(2 mol/L thiourea，7 mol/L urea，4%(w/v)CHAPS，1%(w/v)DTT，2%(v/v)carrier ampholytes pH 3-10)Bradford法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度.取100 μg蛋白樣品利用裂解緩沖液定容至125 μL，20 ℃水化IPG膠條(IPG strip pH3-10 NL，7 cm)15 h.在等電聚焦儀(PROTEAN i12 IEF Cell，Bio-Rad，USA)中進(jìn)行等電聚焦.運(yùn)行參數(shù)：250 V Rapid 15 min；4000 V Gradual 60 min；4000 V Rapid 15 000 Vhr；500 V Hold.等電聚焦完畢后，在10 mL平衡緩沖液(6 mol/L urea，75 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)，29.3%(v/v)glycerol，2%(w/v)SDS，0.002%(w/v)bromophenol blue)中平衡2次，每次15 min.第一次平衡液中加入100 mg二硫蘇糖醇，第二次平衡液中加入250 mg碘乙酰胺.使用Mini-PROTEAN Tetra Cell(Bio-Rad，USA)垂直電泳儀進(jìn)行第二向SDS-PAGE電泳.分離膠濃度為12.5%，濃縮膠濃度為5%.電壓設(shè)定為120 V，電泳1.5 h.考馬斯亮藍(lán)G-250染色.利用凝膠掃描儀ChemiDoc XRS+ Imaging System(Bio-Rad，USA)采集圖像，掃描模式為Transmission mode，分辨率為600 dpi，保存為TIF格式的圖像文件.運(yùn)用Image Master 2D Elite software(Amersham Pharmacia Biotech，Sweden)軟件進(jìn)行分析.挑選豐度最高的5個(gè)蛋白點(diǎn)送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，使用儀器為MALDI-TOF-TOF-MS ABI 4800串聯(lián)質(zhì)譜(ABI，USA)，檢測(cè)結(jié)果利用MASCOT搜索引擎(Matrix Science Ltd., London，UK)進(jìn)行搜索.MASCOT MS/MS Ions搜索參數(shù)的設(shè)置為：Enzyme：Trypsin；Fixed modifications：Carbamidomethyl(C)；Variable modifications：Acetyl(Protein N-term)，Deamidated (NQ)，Dioxidation(W)，Oxidation(M)；Mass values：Monoisotopic；Peptide Mass Tolerance：±100 ppm；Fragment Mass Tolerance：±0.3 Da；Max Missed Cleavages：1；Instrument type：MALDI-TOF-TOF.

1.4 葡萄籽蛋白的氨基酸組成分析

樣品用含2%(w/v)苯酚的6 mol/L鹽酸混合，充N2，熔封，置110 ℃水解20 h.旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加硼砂緩沖液溶解，OPA/FMOC柱前自動(dòng)衍生化后上樣分析[15].分析柱：hypersil ODS柱 5 μm 4.0×125 mm(Thermo，USA)；流動(dòng)相A：20 mmol/L NaAc(pH7.6)，含0.018%(v/v)三乙胺(TEA)和0.3%(v/v)四氫呋喃(THF)；流動(dòng)相B：100 mmol/L NaAc(pH7.2)、CH3OH及CH3CN的混合物，3種物質(zhì)體積比為1︰2︰2；流速：1 mL/min；柱溫：40 ℃；DAD UV檢測(cè)器： Signal A=338/10 nm Ref =390/20 nm，Signal B=262/16 nm Ref=324/8 nm.

1.5 葡萄籽蛋白紅外光譜測(cè)定

將干燥的2 mg蛋白樣品與200 mg溴化鉀研磨均勻，置于模具中，用5×107Pa壓力在油壓機(jī)上壓成透明薄片，采用Nicolet Magna IR 560傅里葉變換紅外光譜儀(Thermo Nicolet，USA)在4000～400 cm-1波數(shù)范圍測(cè)定吸收光譜[16].掃描次數(shù)128次，分辨率4 cm-1.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 葡萄籽化學(xué)成分組成

表1葡萄籽主要成分及金屬元素含量

Tab.1Themaincomponentsandmetalelementscontentofgrapeseeds

主要成分/%金屬元素/(g/kg)金屬元素/(mg/kg)蛋白質(zhì)9.57±1.77鈣4.536±0.171鐵54.281±7.067水分 36.62±2.14鎂0.753±0.036鋅11.243±1.694灰分 3.11±0.25鉀1.372±0.085砷 0.469±0.018油脂 13.56±1.18磷2.287±0.114鎘 0.049±0.004

葡萄籽中蛋白質(zhì)含量豐富，約占總重的1/10，同時(shí)水分及油脂含量超過了50%(表1).因此，葡萄籽經(jīng)過榨油等工藝后，籽粕中蛋白質(zhì)含量會(huì)進(jìn)一步提高.同時(shí)，葡萄籽中富含鈣、磷、鉀及鎂，砷含量低于糧食國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)(0.7 mg/kg)及重金屬鎘含量低于谷物類歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)(0.1 mg/kg)(表1).在原料產(chǎn)量及食品安全性方面為葡萄籽蛋白的開發(fā)及應(yīng)用提供了保障.

2.2 葡萄籽高豐度蛋白鑒定

圖1 葡萄籽蛋白雙向電泳凝膠圖譜

利用雙向電泳分離葡萄籽總蛋白(圖1)，蛋白點(diǎn)主要分布在15～50 kDa之間，酸性端(正極)及堿性端(負(fù)極)均有分布，通過Image Master 2D Elite software軟件識(shí)別分析，總數(shù)在30～40之間.蛋白點(diǎn)較少的原因可能是因?yàn)槠咸炎阎懈吆康亩喾游镔|(zhì)及油脂干擾，導(dǎo)致疏水性蛋白質(zhì)的丟失.同時(shí)也可能因?yàn)槠咸炎阎兄饕鞍缀窟^高，導(dǎo)致凝膠背景較深，影響了軟件對(duì)低豐度蛋白的識(shí)別.選擇豐度最高的5個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜鑒定.鑒定結(jié)果(表2)通過數(shù)據(jù)庫比對(duì)發(fā)現(xiàn)，5個(gè)蛋白點(diǎn)的Mascot值均超過閾值，同屬于Vitisvinifera，肽段匹配數(shù)至少為9個(gè)，序列覆蓋率超過20%.盡管實(shí)際分子量和等電點(diǎn)有所不同，但蛋白點(diǎn)S1和S3的鑒定結(jié)果均指向11S globulin subunit beta-like isoform 1，蛋白點(diǎn)S2、S4和S5鑒定結(jié)果均指向legumin A-like isoform 1，不同蛋白點(diǎn)鑒定為同一蛋白的現(xiàn)象可能與該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化、亞基組成或翻譯后修飾有關(guān).11S globulin subunit beta是一個(gè)種子貯藏蛋白，由一個(gè)11S globulin gamma chains 和11S globulin Delta chains通過一個(gè)二硫鍵形成，該蛋白是一個(gè)鎂離子結(jié)合蛋白，翻譯后修飾是通過N末端谷氨酰胺的環(huán)化完成.其功能主要是提供鎂離子結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)具有營(yíng)養(yǎng)貯藏功能，這與Zhou等的研究結(jié)果[17]是一致的.Legumin A也是屬于11S種子貯藏蛋白，同樣由Legumin A alpha chain 和Legumin A beta chain通過一個(gè)二硫鍵形成.該蛋白存在于許多豆科或非豆科植物種子中，作為膳食可提供豐富的含硫氨基酸，其主要功能也是貯藏營(yíng)養(yǎng)(http://www.uniprot.org).因此可以推斷，葡萄籽蛋白主要由11S球蛋白構(gòu)成，其主要功能為營(yíng)養(yǎng)貯藏.

表2 葡萄籽高豐度蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果

b為匹配蛋白的理論分子量及理論等電點(diǎn);

c括號(hào)外為與蛋白匹配上的肽段數(shù)量，括號(hào)內(nèi)為分值超過閾值的肽段數(shù)量;

d肽段在匹配蛋白總序列中的覆蓋率.

2.3 葡萄籽蛋白的氨基酸組成

葡萄籽蛋白中氨基酸的組成與其他很多植物種子11S球蛋白的氨基酸組成相近(表3)，與大豆分離蛋白中含量相似的氨基酸是精氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；與其他豆科類植物種子蛋白一樣，葡萄籽總蛋白缺乏含硫氨基酸，甲硫氨酸和半胱氨酸含量分別僅為0.86%和0.90%；葡萄籽蛋白中酸性、堿性、不帶電荷的極性氨基酸以及疏水氨基酸分別占總氨基酸含量的30.16%，8.56%，55.18%和36.25%；呈味氨基酸(天冬酰胺和谷氨酸)和甜味型氨基酸(甘氨酸和丙氨酸)分別占葡萄籽總蛋白中總氨基酸含量的30.16%和20.83%.此外，除了色氨酸，葡萄籽總蛋白中幾乎含有人體所有的必需氨基酸，約占總氨基酸含量的27.43%.其中，亮氨酸(7.86%)、纈氨酸(6.53%)以及異亮氨酸(4.63%)是最豐富的必需氨基酸.因此，作為種子貯藏蛋白的葡萄籽蛋白，含有均衡的氨基酸組成和高含量的精氨酸，與大豆分離蛋白具有相似結(jié)構(gòu)組成，具有成為蛋白質(zhì)或者氨基酸的膳食補(bǔ)充劑的潛力.

表3葡萄籽蛋白和大豆分離蛋白中氨基酸組成比較

Tab.3Acomparisonofaminoacidcompositionbetweengrapeseedsproteinandsoybeanproteinisolate

注：圖中數(shù)值為3次重復(fù)的均值±標(biāo)準(zhǔn)方差，ND代表沒有檢測(cè)到；GlxA=谷氨酸+谷氨酰胺；AsxB=天冬氨酸+天冬酰胺；CysC：胱氨酸+半胱氨酸；D 代表必需氨基酸.

2.4 葡萄籽蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過紅外光譜測(cè)定pH 7條件下的葡萄籽蛋白中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化(圖2).根據(jù)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)紅外光譜特征譜帶和蛋白質(zhì)特征吸收峰的歸屬可知，1 660～1 669 cm-1譜峰是酰胺I帶C=O的伸縮振動(dòng)，1 535～1 539 cm-1譜峰是酰胺II帶C—N的伸縮振動(dòng)和N—H的面內(nèi)變形振動(dòng)，1 231～1 232 cm-1譜峰為酰胺III帶C—N伸縮振動(dòng)和N—H面內(nèi)變形振動(dòng).葡萄籽蛋白光譜在3 300 cm-1左右有明顯的單峰，是蛋白質(zhì)N—H伸縮振動(dòng)和O—H伸縮振動(dòng)的特征吸收峰.在以無規(guī)則卷曲構(gòu)象為特征吸收的酰胺I譜帶1 660～1 669 cm-1處、酰胺II譜帶1 535～1 539 cm-1和酰胺III譜帶1 235 cm-1附近處都有明顯較強(qiáng)的吸收峰，說明葡萄籽蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中都是以無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)為主.葡萄籽蛋白在1 288～1 290 cm-1有明顯的吸收，說明葡萄籽蛋白中也含有較多的α-螺旋結(jié)構(gòu)(1 300～1 250 cm-1)，葡萄籽蛋白在1 231 cm-1附近的吸收代表其中的β-折疊結(jié)構(gòu)(1 240～1 230 cm-1)也較穩(wěn)定，且含量少于α-螺旋結(jié)構(gòu).

圖2 傅里葉變換紅外光譜分析葡萄籽蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

3 討 論

葡萄籽蛋白是葡萄籽的重要組分之一，其營(yíng)養(yǎng)成分與其他油料作物或谷物種子蛋白具備一定的相似性，具有開發(fā)成膳食蛋白或功能蛋白的潛力.Wu和Lu通過電泳技術(shù)在葡萄籽中找到了一種Haze-Active蛋白[18]；葡萄籽蛋白還具有一些功能活性，如良好的可溶性及乳化性[19]，其蛋白提取物還可以用作葡萄酒的澄清劑[20]，表明葡萄籽蛋白還擁有特有的功能活性.因此，加強(qiáng)葡萄籽蛋白組成、結(jié)構(gòu)及功能的研究具有一定的現(xiàn)實(shí)意義.在此背景下，本研究首先對(duì)葡萄籽各主要成分和金屬元素的含量進(jìn)行了評(píng)估，確定了葡萄籽蛋白的應(yīng)用基礎(chǔ)；通過雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜鑒定手段，確定了葡萄籽蛋白的主要成分為11S球蛋白，其功能主要是營(yíng)養(yǎng)貯藏；通過氨基酸組成檢測(cè)及比較分析，確定了葡萄籽蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；最后利用紅外光譜分析，對(duì)葡萄籽蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析.研究結(jié)果將為葡萄籽蛋白的綜合利用及功能性產(chǎn)品的研發(fā)提供理論基礎(chǔ).

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