HPLC—MS—MS測(cè)定水產(chǎn)品中的甲基睪丸酮?dú)埩袅?/h1>
2014-08-27 21:11馬瑞欣蘇歡歡梁艷紅孫偉彬郝新麗
河北漁業(yè) 2014年8期
馬瑞欣+蘇歡歡+梁艷紅+孫偉彬+郝新麗+張勇
摘 要：在研究基質(zhì)效應(yīng)的基礎(chǔ)上，建立了乙酸乙酯提取，石油醚凈化，氘代甲基睪丸酮為內(nèi)標(biāo)，甲醇和5 mmol/L乙酸銨（含0.15%甲酸）為流動(dòng)相，梯度洗脫，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS-MS）測(cè)定水產(chǎn)品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康姆椒āＴ?.0～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性良好，R2≥0.999；定量限為5.0 μg/Kg?？瞻讟悠诽砑訕?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)后的回收率在75%～105%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤10%。該方法前處理簡(jiǎn)單，可適用于批量水產(chǎn)品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康目焖俣ㄐ远繖z測(cè)。
關(guān)鍵詞：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS-MS）；水產(chǎn)品；甲基睪丸酮；內(nèi)標(biāo)法
17-α-甲基睪丸酮（17-αlpha-methyltestosterone）是一種人工合成的雄性激素，水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用可提高產(chǎn)量，但在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)代謝緩慢，其殘留會(huì)對(duì)人體造成危害。歐盟國(guó)家禁止在食品動(dòng)物中使用甲基睪丸酮及其化合物，我國(guó)已經(jīng)把甲基睪丸酮列入食品動(dòng)物禁用的獸藥清單[1]。
檢測(cè)水產(chǎn)品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康姆椒ㄓ懈咝б合嗌V法[2]和液質(zhì)聯(lián)用法[3-5]。液相色譜法[2]仍是目前農(nóng)業(yè)部下達(dá)水產(chǎn)品抽查任務(wù)中的唯一方法，但其存在兩個(gè)問(wèn)題：一是樣品基線干擾大，難以達(dá)到10 μg/kg的檢測(cè)限，且容易出現(xiàn)假陽(yáng)性[6]，造成定性和定量的不準(zhǔn)確；二是采用乙醚提取，乙醚揮發(fā)性很強(qiáng)，易被氧化成過(guò)氧化物，過(guò)氧化物不穩(wěn)定，加熱易爆炸，給實(shí)驗(yàn)操作人員帶來(lái)一定的安全隱患。雖然有文獻(xiàn)對(duì)液相色譜法進(jìn)行了改進(jìn)[7-8]，但效果仍不理想。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的測(cè)定方法[3-5]前處理需固相萃取凈化，操作步驟太過(guò)繁瑣，不適用于實(shí)驗(yàn)室批量檢測(cè)任務(wù)。
本文在考慮基質(zhì)效應(yīng)的基礎(chǔ)上，建立了以氘代甲基睪丸酮（methyltestosterone-D3）為內(nèi)標(biāo)，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康姆椒?。該方法前處理?jiǎn)單，回收率高，實(shí)用性強(qiáng)，可適用于批量水產(chǎn)品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康目焖俣ㄐ远繖z測(cè)。
1 材料與方法
1.1 主要儀器與設(shè)備
高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（Thermofisher，ACCLE-TSQ QUANTUMN ACCESS MAX）；MS3數(shù)顯型振蕩器（廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司）；離心機(jī)（湖南湘儀，TDZ5-WS）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（英國(guó)，Bibby，RE300），高速離心機(jī)（上海安亭，TGL-16C）；十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)賽多利斯）；超純水儀（milipore）。
1.2 主要試劑與材料
17-α-甲基睪丸酮（DR，純度98%）；氘代甲基睪丸酮（WITEGA，純度99.5%）；乙酸乙酯（色譜純，B&J）；甲醇（色譜純，fisher）；甲酸（色譜純，DIKMA）；石油醚（色譜純，天津光復(fù)）；乙酸銨（色譜純，美國(guó)fisher）。實(shí)驗(yàn)所用水為超純水。
甲醇溶液：取80 mL甲醇加入20 mL水。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
2.1.1 17-α-甲基睪酮儲(chǔ)備液 準(zhǔn)確稱取10.2 mg甲基睪丸酮（純度98%）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液，棕色瓶中-18 ℃保存。
2.1.2 氘代甲基睪酮儲(chǔ)備液 準(zhǔn)確稱取5.0 mg甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解并定容至50 mL，配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液，棕色瓶中-18 ℃保存。
2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)系列的配制 取甲基睪酮儲(chǔ)備液和氘代甲基睪酮儲(chǔ)備液分別用甲醇稀釋成1.0 μg/mL的溶液，取此溶液用甲醇溶液稀釋成2.0、5.0、10、20、50、100、500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，內(nèi)標(biāo)濃度為100 ng/mL。
2.2 樣品提取
在50 mL離心試管中稱取樣品5.00g，加入1.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液200 μL，渦旋混勻30 s，放置30 min后，加入20 mL乙酸乙酯，3 000 r/min渦旋振蕩2 min，4 000 r/min離心3 min，把乙酸乙酯層移入100 mL雞心瓶中。在離心試管中再加入20 mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并乙酸乙酯，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。在雞心瓶中加入2 mL甲醇溶液渦旋振蕩1 min，加入2 mL石油醚，渦旋混合30 s，靜止分層，棄去上層石油醚，再加入2 mL石油醚，渦旋混合30 s，取下層溶液10 000 r/min離心5 min，過(guò)0.2 m濾膜后高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。
2.3 儀器條件
2.3.1 色譜條件 色譜柱：hypersil gold 50×2.1，1.9 μm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相A： 5 mmol/L乙酸銨（含0.15%甲酸）；流動(dòng)相B：甲醇；流速：250 μL/min；梯度洗脫如表1。
2.3.2 質(zhì)譜條件
離子化模式：電噴霧正離子模式（ESI+），選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）；噴霧電壓（spray voltage）3 000V；蒸汽溫度（vaperizer temperature）300 ℃；離子傳輸毛細(xì)管溫度（capillary temperature）270 ℃；鞘氣（sheath gas pressure）40；輔氣（Aux gas pressure）10。
選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子和碰撞能見(jiàn)表2。
2.3.3 結(jié)果計(jì)算 測(cè)定結(jié)果由儀器工作站按照內(nèi)標(biāo)法自動(dòng)計(jì)算。樣品中甲基睪丸酮的量按式（1）計(jì)算。
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1 定性分析
甲基睪丸酮的定量離子為97.200，定性離子為109.48，其豐度之比在100%±20%之間，則定為陽(yáng)性。標(biāo)準(zhǔn)溶液離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)圖1。
圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 ng/mL）特征離子質(zhì)量色譜圖
3.2 定量分析
圖2 工作曲線3.2.1 線性范圍 在2.0～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性良好，R2≥0.999，見(jiàn)圖2。
3.2.2 靈敏度 實(shí)驗(yàn)表明，甲基睪丸酮的檢測(cè)限為1.0 μg/kg；定量限為5.0 μg/kg，信噪比≥10，平行樣品的RSD≤15%。
3.2.3 準(zhǔn)確度和精密度 分別向?qū)ξr和羅非魚(yú)的空白樣品中添加17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，添加水平5.0 μg/kg、10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、50.0 μg/kg，每個(gè)添加水平做平行樣品6個(gè)，按上述方法檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果平均回收率在77.10%～102.19%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤10%，詳見(jiàn)表3?？瞻讟悠泛吞砑訕?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的樣品譜圖見(jiàn)圖3。
4 討論
4.1 提取溶劑的選擇
實(shí)驗(yàn)選取了乙腈、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和二氯甲烷分別作為提取溶劑，并分別用甲醇溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和用空白樣品提取液配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)評(píng)定基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率[9-10]，基質(zhì)為羅非魚(yú)，見(jiàn)表4。其中：set1： 甲醇溶液配制的17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，set2： 羅非魚(yú)空白樣品提取后添加17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，set3： 羅非魚(yú)空白樣品添加17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)行提取，基質(zhì)效應(yīng)為ME=set2/set1，提取回收率為RE=set3/set2。ME 值越小，表明基質(zhì)效應(yīng)越嚴(yán)重；RE值越大，表明所用溶劑的提取回收率越高。由表4可知：四種提取劑中，乙酸乙酯和二氯甲烷的基質(zhì)效應(yīng)??；乙酸乙酯和甲基叔丁基醚的提取效率高；因此選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。實(shí)驗(yàn)表明，乙酸乙酯提取后的樣品溶液在目標(biāo)化合物周圍無(wú)干擾物質(zhì)存在。
4.2 凈化溶劑的選擇
實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：用空白樣品提取液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液（基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液）經(jīng)正己烷萃取后，甲基睪丸酮的定量離子峰面積是萃取前的30%左右，見(jiàn)表5。而石油醚萃取后基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積基本無(wú)變化。因此本實(shí)驗(yàn)利用石油醚進(jìn)行除雜凈化。
4.3 實(shí)驗(yàn)方法的確定
由于基質(zhì)效應(yīng)比較嚴(yán)重，本文采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行檢測(cè)，甲醇和5 mmol/L乙酸銨（含0.15%甲酸）作為流動(dòng)相，梯度洗脫，以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。
5 結(jié)論
在考察基質(zhì)效應(yīng)的基礎(chǔ)上，建立了乙酸乙酯提取、石油醚凈化、內(nèi)標(biāo)法測(cè)定水產(chǎn)品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康母咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法前處理簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度和精密度良好，檢出限5.0 μg/kg，完全滿足我國(guó)水產(chǎn)品中甲基睪丸酮10.0 μg/kg的檢出要求，可適用于實(shí)驗(yàn)室中甲基睪丸酮的批量檢測(cè)。
參考文獻(xiàn)：
[1] 全國(guó)水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì). NY 5071-2002 無(wú)公害食品 漁用藥物使用準(zhǔn)則[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2002
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[9] 趙建暉，唐慶強(qiáng)，吳文凡，等.固相萃取-超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定水產(chǎn)品中左氧氟沙星殘留[J]. 福建分析測(cè)試，2011，20（5）：15-19
[10] 王立琦，曾振靈，束建花，等.液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定豬組織中β-興奮劑殘留的基質(zhì)效應(yīng)[J].分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào)，2013，40（9）：1445-1449
圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 ng/mL）特征離子質(zhì)量色譜圖
3.2 定量分析
圖2 工作曲線3.2.1 線性范圍 在2.0～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性良好，R2≥0.999，見(jiàn)圖2。
3.2.2 靈敏度 實(shí)驗(yàn)表明，甲基睪丸酮的檢測(cè)限為1.0 μg/kg；定量限為5.0 μg/kg，信噪比≥10，平行樣品的RSD≤15%。
3.2.3 準(zhǔn)確度和精密度 分別向?qū)ξr和羅非魚(yú)的空白樣品中添加17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，添加水平5.0 μg/kg、10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、50.0 μg/kg，每個(gè)添加水平做平行樣品6個(gè)，按上述方法檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果平均回收率在77.10%～102.19%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤10%，詳見(jiàn)表3?？瞻讟悠泛吞砑訕?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的樣品譜圖見(jiàn)圖3。
4 討論
4.1 提取溶劑的選擇
實(shí)驗(yàn)選取了乙腈、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和二氯甲烷分別作為提取溶劑，并分別用甲醇溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和用空白樣品提取液配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)評(píng)定基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率[9-10]，基質(zhì)為羅非魚(yú)，見(jiàn)表4。其中：set1： 甲醇溶液配制的17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，set2： 羅非魚(yú)空白樣品提取后添加17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，set3： 羅非魚(yú)空白樣品添加17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)行提取，基質(zhì)效應(yīng)為ME=set2/set1，提取回收率為RE=set3/set2。ME 值越小，表明基質(zhì)效應(yīng)越嚴(yán)重；RE值越大，表明所用溶劑的提取回收率越高。由表4可知：四種提取劑中，乙酸乙酯和二氯甲烷的基質(zhì)效應(yīng)??；乙酸乙酯和甲基叔丁基醚的提取效率高；因此選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。實(shí)驗(yàn)表明，乙酸乙酯提取后的樣品溶液在目標(biāo)化合物周圍無(wú)干擾物質(zhì)存在。
4.2 凈化溶劑的選擇
實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：用空白樣品提取液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液（基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液）經(jīng)正己烷萃取后，甲基睪丸酮的定量離子峰面積是萃取前的30%左右，見(jiàn)表5。而石油醚萃取后基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積基本無(wú)變化。因此本實(shí)驗(yàn)利用石油醚進(jìn)行除雜凈化。
4.3 實(shí)驗(yàn)方法的確定
由于基質(zhì)效應(yīng)比較嚴(yán)重，本文采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行檢測(cè)，甲醇和5 mmol/L乙酸銨（含0.15%甲酸）作為流動(dòng)相，梯度洗脫，以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。
5 結(jié)論
在考察基質(zhì)效應(yīng)的基礎(chǔ)上，建立了乙酸乙酯提取、石油醚凈化、內(nèi)標(biāo)法測(cè)定水產(chǎn)品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康母咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法前處理簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度和精密度良好，檢出限5.0 μg/kg，完全滿足我國(guó)水產(chǎn)品中甲基睪丸酮10.0 μg/kg的檢出要求，可適用于實(shí)驗(yàn)室中甲基睪丸酮的批量檢測(cè)。
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[5] 鄭重鶯，王揚(yáng)，周凡，等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定羅非魚(yú)中甲基睪丸酮?dú)埩鬧J].中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2013，3（3）：78-82
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[9] 趙建暉，唐慶強(qiáng)，吳文凡，等.固相萃取-超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定水產(chǎn)品中左氧氟沙星殘留[J]. 福建分析測(cè)試，2011，20（5）：15-19
[10] 王立琦，曾振靈，束建花，等.液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定豬組織中β-興奮劑殘留的基質(zhì)效應(yīng)[J].分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào)，2013，40（9）：1445-1449
圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 ng/mL）特征離子質(zhì)量色譜圖
3.2 定量分析
圖2 工作曲線3.2.1 線性范圍 在2.0～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性良好，R2≥0.999，見(jiàn)圖2。
3.2.2 靈敏度 實(shí)驗(yàn)表明，甲基睪丸酮的檢測(cè)限為1.0 μg/kg；定量限為5.0 μg/kg，信噪比≥10，平行樣品的RSD≤15%。
3.2.3 準(zhǔn)確度和精密度 分別向?qū)ξr和羅非魚(yú)的空白樣品中添加17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，添加水平5.0 μg/kg、10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、50.0 μg/kg，每個(gè)添加水平做平行樣品6個(gè)，按上述方法檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果平均回收率在77.10%～102.19%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤10%，詳見(jiàn)表3?？瞻讟悠泛吞砑訕?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的樣品譜圖見(jiàn)圖3。
4 討論
4.1 提取溶劑的選擇
實(shí)驗(yàn)選取了乙腈、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和二氯甲烷分別作為提取溶劑，并分別用甲醇溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和用空白樣品提取液配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)評(píng)定基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率[9-10]，基質(zhì)為羅非魚(yú)，見(jiàn)表4。其中：set1： 甲醇溶液配制的17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，set2： 羅非魚(yú)空白樣品提取后添加17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，set3： 羅非魚(yú)空白樣品添加17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)行提取，基質(zhì)效應(yīng)為ME=set2/set1，提取回收率為RE=set3/set2。ME 值越小，表明基質(zhì)效應(yīng)越嚴(yán)重；RE值越大，表明所用溶劑的提取回收率越高。由表4可知：四種提取劑中，乙酸乙酯和二氯甲烷的基質(zhì)效應(yīng)?。灰宜嵋阴ズ图谆宥』训奶崛⌒矢?；因此選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。實(shí)驗(yàn)表明，乙酸乙酯提取后的樣品溶液在目標(biāo)化合物周圍無(wú)干擾物質(zhì)存在。
4.2 凈化溶劑的選擇
實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：用空白樣品提取液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液（基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液）經(jīng)正己烷萃取后，甲基睪丸酮的定量離子峰面積是萃取前的30%左右，見(jiàn)表5。而石油醚萃取后基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積基本無(wú)變化。因此本實(shí)驗(yàn)利用石油醚進(jìn)行除雜凈化。
4.3 實(shí)驗(yàn)方法的確定
由于基質(zhì)效應(yīng)比較嚴(yán)重，本文采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行檢測(cè)，甲醇和5 mmol/L乙酸銨（含0.15%甲酸）作為流動(dòng)相，梯度洗脫，以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。
5 結(jié)論
在考察基質(zhì)效應(yīng)的基礎(chǔ)上，建立了乙酸乙酯提取、石油醚凈化、內(nèi)標(biāo)法測(cè)定水產(chǎn)品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康母咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法前處理簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度和精密度良好，檢出限5.0 μg/kg，完全滿足我國(guó)水產(chǎn)品中甲基睪丸酮10.0 μg/kg的檢出要求，可適用于實(shí)驗(yàn)室中甲基睪丸酮的批量檢測(cè)。
參考文獻(xiàn)：
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馬瑞欣+蘇歡歡+梁艷紅+孫偉彬+郝新麗+張勇
摘 要：在研究基質(zhì)效應(yīng)的基礎(chǔ)上，建立了乙酸乙酯提取，石油醚凈化，氘代甲基睪丸酮為內(nèi)標(biāo)，甲醇和5 mmol/L乙酸銨（含0.15%甲酸）為流動(dòng)相，梯度洗脫，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS-MS）測(cè)定水產(chǎn)品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康姆椒āＴ?.0～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性良好，R2≥0.999；定量限為5.0 μg/Kg?？瞻讟悠诽砑訕?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)后的回收率在75%～105%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤10%。該方法前處理簡(jiǎn)單，可適用于批量水產(chǎn)品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康目焖俣ㄐ远繖z測(cè)。
關(guān)鍵詞：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS-MS）；水產(chǎn)品；甲基睪丸酮；內(nèi)標(biāo)法
17-α-甲基睪丸酮（17-αlpha-methyltestosterone）是一種人工合成的雄性激素，水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用可提高產(chǎn)量，但在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)代謝緩慢，其殘留會(huì)對(duì)人體造成危害。歐盟國(guó)家禁止在食品動(dòng)物中使用甲基睪丸酮及其化合物，我國(guó)已經(jīng)把甲基睪丸酮列入食品動(dòng)物禁用的獸藥清單[1]。
檢測(cè)水產(chǎn)品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康姆椒ㄓ懈咝б合嗌V法[2]和液質(zhì)聯(lián)用法[3-5]。液相色譜法[2]仍是目前農(nóng)業(yè)部下達(dá)水產(chǎn)品抽查任務(wù)中的唯一方法，但其存在兩個(gè)問(wèn)題：一是樣品基線干擾大，難以達(dá)到10 μg/kg的檢測(cè)限，且容易出現(xiàn)假陽(yáng)性[6]，造成定性和定量的不準(zhǔn)確；二是采用乙醚提取，乙醚揮發(fā)性很強(qiáng)，易被氧化成過(guò)氧化物，過(guò)氧化物不穩(wěn)定，加熱易爆炸，給實(shí)驗(yàn)操作人員帶來(lái)一定的安全隱患。雖然有文獻(xiàn)對(duì)液相色譜法進(jìn)行了改進(jìn)[7-8]，但效果仍不理想。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的測(cè)定方法[3-5]前處理需固相萃取凈化，操作步驟太過(guò)繁瑣，不適用于實(shí)驗(yàn)室批量檢測(cè)任務(wù)。
本文在考慮基質(zhì)效應(yīng)的基礎(chǔ)上，建立了以氘代甲基睪丸酮（methyltestosterone-D3）為內(nèi)標(biāo)，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康姆椒?。該方法前處理?jiǎn)單，回收率高，實(shí)用性強(qiáng)，可適用于批量水產(chǎn)品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康目焖俣ㄐ远繖z測(cè)。
1 材料與方法
1.1 主要儀器與設(shè)備
高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（Thermofisher，ACCLE-TSQ QUANTUMN ACCESS MAX）；MS3數(shù)顯型振蕩器（廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司）；離心機(jī)（湖南湘儀，TDZ5-WS）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（英國(guó)，Bibby，RE300），高速離心機(jī)（上海安亭，TGL-16C）；十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)賽多利斯）；超純水儀（milipore）。
1.2 主要試劑與材料
17-α-甲基睪丸酮（DR，純度98%）；氘代甲基睪丸酮（WITEGA，純度99.5%）；乙酸乙酯（色譜純，B&J）；甲醇（色譜純，fisher）；甲酸（色譜純，DIKMA）；石油醚（色譜純，天津光復(fù)）；乙酸銨（色譜純，美國(guó)fisher）。實(shí)驗(yàn)所用水為超純水。
甲醇溶液：取80 mL甲醇加入20 mL水。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
2.1.1 17-α-甲基睪酮儲(chǔ)備液 準(zhǔn)確稱取10.2 mg甲基睪丸酮（純度98%）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液，棕色瓶中-18 ℃保存。
2.1.2 氘代甲基睪酮儲(chǔ)備液 準(zhǔn)確稱取5.0 mg甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解并定容至50 mL，配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液，棕色瓶中-18 ℃保存。
2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)系列的配制 取甲基睪酮儲(chǔ)備液和氘代甲基睪酮儲(chǔ)備液分別用甲醇稀釋成1.0 μg/mL的溶液，取此溶液用甲醇溶液稀釋成2.0、5.0、10、20、50、100、500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，內(nèi)標(biāo)濃度為100 ng/mL。
2.2 樣品提取
在50 mL離心試管中稱取樣品5.00g，加入1.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液200 μL，渦旋混勻30 s，放置30 min后，加入20 mL乙酸乙酯，3 000 r/min渦旋振蕩2 min，4 000 r/min離心3 min，把乙酸乙酯層移入100 mL雞心瓶中。在離心試管中再加入20 mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并乙酸乙酯，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。在雞心瓶中加入2 mL甲醇溶液渦旋振蕩1 min，加入2 mL石油醚，渦旋混合30 s，靜止分層，棄去上層石油醚，再加入2 mL石油醚，渦旋混合30 s，取下層溶液10 000 r/min離心5 min，過(guò)0.2 m濾膜后高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。
2.3 儀器條件
2.3.1 色譜條件 色譜柱：hypersil gold 50×2.1，1.9 μm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相A： 5 mmol/L乙酸銨（含0.15%甲酸）；流動(dòng)相B：甲醇；流速：250 μL/min；梯度洗脫如表1。
2.3.2 質(zhì)譜條件
離子化模式：電噴霧正離子模式（ESI+），選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）；噴霧電壓（spray voltage）3 000V；蒸汽溫度（vaperizer temperature）300 ℃；離子傳輸毛細(xì)管溫度（capillary temperature）270 ℃；鞘氣（sheath gas pressure）40；輔氣（Aux gas pressure）10。
選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子和碰撞能見(jiàn)表2。
2.3.3 結(jié)果計(jì)算 測(cè)定結(jié)果由儀器工作站按照內(nèi)標(biāo)法自動(dòng)計(jì)算。樣品中甲基睪丸酮的量按式（1）計(jì)算。
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1 定性分析
甲基睪丸酮的定量離子為97.200，定性離子為109.48，其豐度之比在100%±20%之間，則定為陽(yáng)性。標(biāo)準(zhǔn)溶液離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)圖1。
圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 ng/mL）特征離子質(zhì)量色譜圖
3.2 定量分析
圖2 工作曲線3.2.1 線性范圍 在2.0～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性良好，R2≥0.999，見(jiàn)圖2。
3.2.2 靈敏度 實(shí)驗(yàn)表明，甲基睪丸酮的檢測(cè)限為1.0 μg/kg；定量限為5.0 μg/kg，信噪比≥10，平行樣品的RSD≤15%。
3.2.3 準(zhǔn)確度和精密度 分別向?qū)ξr和羅非魚(yú)的空白樣品中添加17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，添加水平5.0 μg/kg、10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、50.0 μg/kg，每個(gè)添加水平做平行樣品6個(gè)，按上述方法檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果平均回收率在77.10%～102.19%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤10%，詳見(jiàn)表3?？瞻讟悠泛吞砑訕?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的樣品譜圖見(jiàn)圖3。
4 討論
4.1 提取溶劑的選擇
實(shí)驗(yàn)選取了乙腈、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和二氯甲烷分別作為提取溶劑，并分別用甲醇溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和用空白樣品提取液配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)評(píng)定基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率[9-10]，基質(zhì)為羅非魚(yú)，見(jiàn)表4。其中：set1： 甲醇溶液配制的17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，set2： 羅非魚(yú)空白樣品提取后添加17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，set3： 羅非魚(yú)空白樣品添加17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)行提取，基質(zhì)效應(yīng)為ME=set2/set1，提取回收率為RE=set3/set2。ME 值越小，表明基質(zhì)效應(yīng)越嚴(yán)重；RE值越大，表明所用溶劑的提取回收率越高。由表4可知：四種提取劑中，乙酸乙酯和二氯甲烷的基質(zhì)效應(yīng)??；乙酸乙酯和甲基叔丁基醚的提取效率高；因此選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。實(shí)驗(yàn)表明，乙酸乙酯提取后的樣品溶液在目標(biāo)化合物周圍無(wú)干擾物質(zhì)存在。
4.2 凈化溶劑的選擇
實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：用空白樣品提取液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液（基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液）經(jīng)正己烷萃取后，甲基睪丸酮的定量離子峰面積是萃取前的30%左右，見(jiàn)表5。而石油醚萃取后基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積基本無(wú)變化。因此本實(shí)驗(yàn)利用石油醚進(jìn)行除雜凈化。
4.3 實(shí)驗(yàn)方法的確定
由于基質(zhì)效應(yīng)比較嚴(yán)重，本文采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行檢測(cè)，甲醇和5 mmol/L乙酸銨（含0.15%甲酸）作為流動(dòng)相，梯度洗脫，以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。
5 結(jié)論
在考察基質(zhì)效應(yīng)的基礎(chǔ)上，建立了乙酸乙酯提取、石油醚凈化、內(nèi)標(biāo)法測(cè)定水產(chǎn)品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康母咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法前處理簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度和精密度良好，檢出限5.0 μg/kg，完全滿足我國(guó)水產(chǎn)品中甲基睪丸酮10.0 μg/kg的檢出要求，可適用于實(shí)驗(yàn)室中甲基睪丸酮的批量檢測(cè)。
參考文獻(xiàn)：
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圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 ng/mL）特征離子質(zhì)量色譜圖
3.2 定量分析
圖2 工作曲線3.2.1 線性范圍 在2.0～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性良好，R2≥0.999，見(jiàn)圖2。
3.2.2 靈敏度 實(shí)驗(yàn)表明，甲基睪丸酮的檢測(cè)限為1.0 μg/kg；定量限為5.0 μg/kg，信噪比≥10，平行樣品的RSD≤15%。
3.2.3 準(zhǔn)確度和精密度 分別向?qū)ξr和羅非魚(yú)的空白樣品中添加17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，添加水平5.0 μg/kg、10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、50.0 μg/kg，每個(gè)添加水平做平行樣品6個(gè)，按上述方法檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果平均回收率在77.10%～102.19%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤10%，詳見(jiàn)表3?？瞻讟悠泛吞砑訕?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的樣品譜圖見(jiàn)圖3。
4 討論
4.1 提取溶劑的選擇
實(shí)驗(yàn)選取了乙腈、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和二氯甲烷分別作為提取溶劑，并分別用甲醇溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和用空白樣品提取液配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)評(píng)定基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率[9-10]，基質(zhì)為羅非魚(yú)，見(jiàn)表4。其中：set1： 甲醇溶液配制的17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，set2： 羅非魚(yú)空白樣品提取后添加17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，set3： 羅非魚(yú)空白樣品添加17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)行提取，基質(zhì)效應(yīng)為ME=set2/set1，提取回收率為RE=set3/set2。ME 值越小，表明基質(zhì)效應(yīng)越嚴(yán)重；RE值越大，表明所用溶劑的提取回收率越高。由表4可知：四種提取劑中，乙酸乙酯和二氯甲烷的基質(zhì)效應(yīng)??；乙酸乙酯和甲基叔丁基醚的提取效率高；因此選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。實(shí)驗(yàn)表明，乙酸乙酯提取后的樣品溶液在目標(biāo)化合物周圍無(wú)干擾物質(zhì)存在。
4.2 凈化溶劑的選擇
實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：用空白樣品提取液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液（基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液）經(jīng)正己烷萃取后，甲基睪丸酮的定量離子峰面積是萃取前的30%左右，見(jiàn)表5。而石油醚萃取后基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積基本無(wú)變化。因此本實(shí)驗(yàn)利用石油醚進(jìn)行除雜凈化。
4.3 實(shí)驗(yàn)方法的確定
由于基質(zhì)效應(yīng)比較嚴(yán)重，本文采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行檢測(cè)，甲醇和5 mmol/L乙酸銨（含0.15%甲酸）作為流動(dòng)相，梯度洗脫，以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。
5 結(jié)論
在考察基質(zhì)效應(yīng)的基礎(chǔ)上，建立了乙酸乙酯提取、石油醚凈化、內(nèi)標(biāo)法測(cè)定水產(chǎn)品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康母咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法前處理簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度和精密度良好，檢出限5.0 μg/kg，完全滿足我國(guó)水產(chǎn)品中甲基睪丸酮10.0 μg/kg的檢出要求，可適用于實(shí)驗(yàn)室中甲基睪丸酮的批量檢測(cè)。
參考文獻(xiàn)：
[1] 全國(guó)水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì). NY 5071-2002 無(wú)公害食品 漁用藥物使用準(zhǔn)則[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2002
[2] 全國(guó)水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)水產(chǎn)品加工分技術(shù)委員會(huì). SC/T 3029-2006 水產(chǎn)品中甲基睪酮?dú)埩袅康臏y(cè)定 液相色譜法[S]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006
[3] 聶建榮，李大光，鄧香連，等. LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源性食品中甲基睪丸酮和己烯雌酚的 方法研究[J]. 中國(guó)獸藥雜志，2009，43（4）：20-24
[4] 祝璟琳，楊弘，肖煒，等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定羅非魚(yú)肌肉中甲基睪丸酮?dú)埩鬧J].食品科學(xué)，2011，32（22）：243-247
[5] 鄭重鶯，王揚(yáng)，周凡，等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定羅非魚(yú)中甲基睪丸酮?dú)埩鬧J].中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2013，3（3）：78-82
[6] 陳俊.高效液相色譜法檢測(cè)水產(chǎn)品中甲基睪丸酮的假陽(yáng)性分析[J].南方水產(chǎn)，2010，6（6）：74-76
[7] 秦振發(fā)，黎小正. 硅膠柱SPE-HPLC測(cè)定水產(chǎn)品中甲基睪酮的研究[J].食品科技，2009，34（10）：291-294
[8] 陳培基，李劉冬，鄒琴，等.高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康膬?yōu)化研究[J].食品科學(xué)，2010，31（6）：223-226
[9] 趙建暉，唐慶強(qiáng)，吳文凡，等.固相萃取-超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定水產(chǎn)品中左氧氟沙星殘留[J]. 福建分析測(cè)試，2011，20（5）：15-19
[10] 王立琦，曾振靈，束建花，等.液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定豬組織中β-興奮劑殘留的基質(zhì)效應(yīng)[J].分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào)，2013，40（9）：1445-1449
圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 ng/mL）特征離子質(zhì)量色譜圖
3.2 定量分析
圖2 工作曲線3.2.1 線性范圍 在2.0～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性良好，R2≥0.999，見(jiàn)圖2。
3.2.2 靈敏度 實(shí)驗(yàn)表明，甲基睪丸酮的檢測(cè)限為1.0 μg/kg；定量限為5.0 μg/kg，信噪比≥10，平行樣品的RSD≤15%。
3.2.3 準(zhǔn)確度和精密度 分別向?qū)ξr和羅非魚(yú)的空白樣品中添加17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，添加水平5.0 μg/kg、10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、50.0 μg/kg，每個(gè)添加水平做平行樣品6個(gè)，按上述方法檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果平均回收率在77.10%～102.19%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤10%，詳見(jiàn)表3?？瞻讟悠泛吞砑訕?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的樣品譜圖見(jiàn)圖3。
4 討論
4.1 提取溶劑的選擇
實(shí)驗(yàn)選取了乙腈、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和二氯甲烷分別作為提取溶劑，并分別用甲醇溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和用空白樣品提取液配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)評(píng)定基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率[9-10]，基質(zhì)為羅非魚(yú)，見(jiàn)表4。其中：set1： 甲醇溶液配制的17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，set2： 羅非魚(yú)空白樣品提取后添加17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，set3： 羅非魚(yú)空白樣品添加17-α-甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)行提取，基質(zhì)效應(yīng)為ME=set2/set1，提取回收率為RE=set3/set2。ME 值越小，表明基質(zhì)效應(yīng)越嚴(yán)重；RE值越大，表明所用溶劑的提取回收率越高。由表4可知：四種提取劑中，乙酸乙酯和二氯甲烷的基質(zhì)效應(yīng)?。灰宜嵋阴ズ图谆宥』训奶崛⌒矢?；因此選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。實(shí)驗(yàn)表明，乙酸乙酯提取后的樣品溶液在目標(biāo)化合物周圍無(wú)干擾物質(zhì)存在。
4.2 凈化溶劑的選擇
實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：用空白樣品提取液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液（基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液）經(jīng)正己烷萃取后，甲基睪丸酮的定量離子峰面積是萃取前的30%左右，見(jiàn)表5。而石油醚萃取后基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積基本無(wú)變化。因此本實(shí)驗(yàn)利用石油醚進(jìn)行除雜凈化。
4.3 實(shí)驗(yàn)方法的確定
由于基質(zhì)效應(yīng)比較嚴(yán)重，本文采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行檢測(cè)，甲醇和5 mmol/L乙酸銨（含0.15%甲酸）作為流動(dòng)相，梯度洗脫，以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。
5 結(jié)論
在考察基質(zhì)效應(yīng)的基礎(chǔ)上，建立了乙酸乙酯提取、石油醚凈化、內(nèi)標(biāo)法測(cè)定水產(chǎn)品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康母咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法前處理簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度和精密度良好，檢出限5.0 μg/kg，完全滿足我國(guó)水產(chǎn)品中甲基睪丸酮10.0 μg/kg的檢出要求，可適用于實(shí)驗(yàn)室中甲基睪丸酮的批量檢測(cè)。
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[5] 鄭重鶯，王揚(yáng)，周凡，等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定羅非魚(yú)中甲基睪丸酮?dú)埩鬧J].中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2013，3（3）：78-82
[6] 陳俊.高效液相色譜法檢測(cè)水產(chǎn)品中甲基睪丸酮的假陽(yáng)性分析[J].南方水產(chǎn)，2010，6（6）：74-76
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[9] 趙建暉，唐慶強(qiáng)，吳文凡，等.固相萃取-超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定水產(chǎn)品中左氧氟沙星殘留[J]. 福建分析測(cè)試，2011，20（5）：15-19
[10] 王立琦，曾振靈，束建花，等.液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定豬組織中β-興奮劑殘留的基質(zhì)效應(yīng)[J].分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào)，2013，40（9）：1445-1449
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