王艷梅 李秀輕 王俊學(xué)

·藥物研究·

HPLC法測(cè)定鹽酸雷諾嗪在不同種屬血漿中的蛋白結(jié)合率

王艷梅 李秀輕 王俊學(xué)

目的研究鹽酸雷諾嗪與不同種屬血漿的蛋白結(jié)合情況。方法采用高效液相色譜法(HPLC法)和平衡透析法測(cè)定管狀半透膜內(nèi)的血漿藥物濃度及管狀半透膜外的緩沖液中藥物濃度，并計(jì)算蛋白結(jié)合率。結(jié)果鹽酸雷諾嗪在不同種屬血漿(大鼠血漿、人血漿和牛血清白蛋白)中的蛋白結(jié)合率均大于50%，分別為：大鼠血漿：(63.43±1.9)%；人血漿：(61.58±4.1)%；牛血清白蛋白：(62.16±2.9)%。且鹽酸雷諾嗪在各種屬血漿中最低定量下限均為0.05 mg/L。結(jié)論鹽酸雷諾嗪在不同種屬血漿(大鼠血漿、人血漿和牛血清白蛋白)中的蛋白結(jié)合率及蛋白結(jié)合藥物的表觀最大能力均較高。隨著藥物血漿濃度升高，鹽酸雷諾嗪結(jié)合率升高，有較強(qiáng)的濃度依賴性。

鹽酸雷諾嗪；蛋白結(jié)合率；半透膜；平衡透析法；高效液相色譜法

鹽酸雷諾嗪為吡嗪類抗心絞痛藥，具有全新的抗心絞痛機(jī)制，是一種晚鈉離子電流選擇性阻滯劑，通過改善缺血心肌細(xì)胞代謝和氧的利用，達(dá)到抗心肌缺血、抗心律失常和抗心力衰竭作用[1]，該藥于2006 年1月獲得FDA批準(zhǔn)在美國(guó)正式上市[2]，主要用于治療慢性心絞痛。目前，國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)中關(guān)于鹽酸雷諾嗪在不同種屬不同濃度血漿中蛋白結(jié)合的研究筆者未見報(bào)道，本研究通過探索鹽酸雷諾嗪在不同種屬血漿中蛋白結(jié)合情況，進(jìn)一步為該藥在藥效、藥動(dòng)學(xué)等方面的行為差異提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)[3]。

1 儀器與試藥

Waters公司1525-2487型高效液相色譜儀(美國(guó))：1525泵，2487紫外檢測(cè)器；XW-80型旋渦混合器(上海)；管狀半透膜(北京華美，型號(hào)：DM-6(MD-10)USA)。

鹽酸雷諾嗪對(duì)照品(購(gòu)自上海凱峰化工有限公司，批號(hào):060811)；內(nèi)標(biāo)：苯海拉明(批號(hào)：1006631-20089705)由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。大鼠(河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)；人血漿(河北省血液中心提供，批號(hào)：0050107040084)；BSA(Sino-American Biofee公司)。甲醇為色譜純，水為二次重蒸水，其他所用試劑均為分析純?cè)噭?/p>

2 方法

2.1 溶液的配制 對(duì)照品溶液：取鹽酸雷諾嗪和苯海拉明對(duì)照品各適量，精密稱定，分別加甲醇、水溶解配制成濃度為50 mg/L的鹽酸雷諾嗪對(duì)照品溶液和50 mg/L的苯海拉明對(duì)照品溶液。BSA溶液：稱取BSA適量，用重蒸水稀釋成濃度為45 g/L的溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：RESTEKCR C18色譜柱(4.6 mm×250 mm；5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-水(醋酸-醋酸銨緩沖溶液， pH值4.5)(55∶45)，流速為1 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為272 nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為20 μl。見圖1。

圖1 鹽酸雷諾嗪在空白人血漿和磷酸鹽緩沖液中的色譜圖

A.空白血漿；B.鹽酸雷諾嗪與內(nèi)標(biāo)的血漿樣品；C.空白緩沖鹽；D.鹽酸雷諾嗪與內(nèi)標(biāo)的透析袋外樣品；1-內(nèi)標(biāo)苯海拉明；2-鹽酸雷諾嗪

2.3 樣品處理 透析袋內(nèi)血漿和透析袋外緩沖液分別取0.3 ml，分置5 ml離心管中，以5 mol/L的NaOH溶液50 μl堿化樣品后，渦旋10 s混勻，精密加入50 mg/L的苯海拉明溶液50 μl，渦旋10 s， 用3 ml乙醚溶液萃取，渦旋15 s，離心(2 000×g)5 min。 取上清液2.5 ml，N2吹干，40 μl流動(dòng)相溶解，進(jìn)樣，記錄鹽酸雷諾嗪及苯海拉明的色譜峰面積。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 鹽酸雷諾嗪在不同種屬血漿及pH值7.4磷酸鹽緩沖液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密稱取“2.1” 項(xiàng)下鹽酸雷諾嗪溶液適量，加至各血漿和磷酸鹽緩沖液中，分別配制成0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 mg/L和0.005，0.01、0.02、0.04、0.08、0.2、0.5 mg/L濃度的溶液，混合均勻。上述溶液各精密量取0.3 ml，分置5 ml離心管中，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。用鹽酸雷諾嗪與內(nèi)標(biāo)的峰面積比(Y)對(duì)上述相應(yīng)濃度(X)進(jìn)行線性回歸。鹽酸雷諾嗪在各種屬血漿中最低定量下限均為0.05 mg/L，在磷酸鹽中最低定量下限為0.005 mg/L。見表1。

表1 鹽酸雷諾嗪在不同介質(zhì)中的回歸方程、相關(guān)系數(shù)與線性范圍

2.4.2 回收率與精密度試驗(yàn)：按“2.3樣品處理”項(xiàng)下方法，在各血漿和磷酸鹽緩沖液中加入“2.1” 項(xiàng)下鹽酸雷諾嗪溶液，配制成濃度為0.1、1.0、4.0 mg/L的血漿樣品和濃度為0.01、0.1、0.4 mg/L的磷酸鹽緩沖液樣品，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算得鹽酸雷諾嗪在3種濃度不同介質(zhì)中，回收率、日內(nèi)及日間RSD均小于15%，符合生物樣品分析要求。

2.4.3 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)：在4種不同介質(zhì)中，分別配制鹽酸雷諾嗪上述低、中、高3種濃度的樣品，以提取后的藥物峰面積與直接進(jìn)樣的鹽酸雷諾嗪峰面積之比計(jì)算提取回收率。同上用流動(dòng)相代替上述4種介質(zhì)，按“2.3”項(xiàng)下方法(無內(nèi)標(biāo))測(cè)定，記錄峰面積為Y1。另取4種不同介質(zhì)按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，加入低、中、高3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，記錄鹽酸雷諾嗪的峰面積為Y2。計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)ME=Y2/Y1×100%。結(jié)果3種濃度不同介質(zhì)中鹽酸雷諾嗪的提取回收率RSD均小于15%，符合生物樣品分析要求。且基質(zhì)效應(yīng)對(duì)樣品測(cè)定沒有影響。

2.4.4 穩(wěn)定性考察：在4種介質(zhì)中分別加入鹽酸雷諾嗪標(biāo)準(zhǔn)液，配制上述低、中、高3種濃度樣品，每個(gè)濃度平行配制5份樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法，室溫放24 h及在-20℃冷凍10 d，并且三次冷凍-解凍后考察上述樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果3種濃度樣品在上述條件下的4種不同介質(zhì)中均穩(wěn)定，相對(duì)誤差RE均在 ± 10%之內(nèi)，RSD < 15%，符合生物樣品的分析要求。

2.5 人標(biāo)準(zhǔn)血漿和大鼠中蛋白總量的測(cè)定

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線[4]：取”2.1”項(xiàng)下BSA溶液，用純化水稀釋成10、30、50、70、90 μg/ml系列濃度的溶液，采用Lowry法(中國(guó)藥典2005年版)，于650 nm波長(zhǎng)處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的吸光度(A)。以A對(duì)血漿蛋白溶液濃度(C)作線性回歸，得回歸方程為：A=0.0027C-0.0011，r=0.9996(n=5)。

2.5.2 蛋白總量測(cè)定：取大鼠及人血漿，用水稀釋至蛋白質(zhì)濃度100 mg/L以內(nèi)，取1.0 ml置10 ml試管中，按“2.5.1”項(xiàng)下操作，測(cè)定A。以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算，測(cè)得試驗(yàn)所用大鼠和人血漿中的蛋白總量分別為55.20 g/L和75.52 g/L。

2.6 血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定

2.6.1 實(shí)驗(yàn)方法：采用平衡透析法[5]測(cè)定。在裝有磷酸鹽緩沖液的試管中，分別放置裝有0.5 ml各濃度含藥血漿(0.25、0.5、1.0、2.5 mg/L)的透析袋，在4℃的冰箱內(nèi)透析至平衡后，用三氯醋酸試劑檢查袋外透析液有無蛋白漏出。按“2.3”項(xiàng)下方法取透析袋兩側(cè)介質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算藥物濃度。

另取8份，其中4份袋內(nèi)外均為磷酸鹽緩沖液，袋內(nèi)藥物濃度為1.0 mg/L；另外4份未用半透膜，將藥物直接加至磷酸鹽緩沖液，觀察藥物和透析袋之間的結(jié)合情況。另取4份，在透析袋內(nèi)外只含磷酸鹽緩沖液的情況下，考察透析袋對(duì)測(cè)定的影響。結(jié)果表明，藥物與透析袋之間，以及透析袋本身均不影響測(cè)定結(jié)果。

2.6.2 測(cè)定透析平衡時(shí)間：透析袋內(nèi)外均加磷酸鹽緩沖液，其中袋內(nèi)含鹽酸雷諾嗪(1 mg/L)，共20份，分成5組，分別于24、48、72、96 h于袋兩側(cè)取樣，照“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定。不同時(shí)間血漿蛋白結(jié)合率分別為：(36.5±4.1)%、(78.1±4.4)%、(94.6±3.3)%、(95.7±3.8)%。應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，最終確定72 h為透析達(dá)平衡時(shí)間。

2.6.3 蛋白結(jié)合率：用上述方法對(duì)鹽酸雷諾嗪(4種質(zhì)量濃度)樣品透析平衡后，測(cè)定透析袋內(nèi)外藥物總濃度(Dt、Df)。根據(jù)公式：fb=(Dt-Df)/Dt×100%計(jì)算血漿蛋白結(jié)合率。結(jié)果表明，鹽酸雷諾嗪與各種屬血漿的蛋白結(jié)合率均大于50%，且蛋白結(jié)合率隨藥物濃度的增加而升高。見表2。

表2 不同種屬血漿中的蛋白結(jié)合率 ±s

2.6.4 計(jì)算βp及Kdp[6]：根據(jù)公式：Df=βp×[P]·Df/(Df+Dt-Df·W)-Kdp計(jì)算出蛋白結(jié)合藥物的表觀最大能力(βp)和藥物與蛋白復(fù)合物的解離常數(shù)(Kdp)，其中Dt和Df需要折合成摩爾濃度進(jìn)行計(jì)算，W為血漿中的含水量，[P]單位為g/L。以Df作縱坐標(biāo)(Y)，[P]·Df/(Df+Dt-Df·W)作橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸，大鼠蛋白結(jié)合藥物的表觀最大能力和解離常數(shù)均最大。表明鹽酸雷諾嗪與各血漿蛋白結(jié)合參數(shù)之間有很大的差異，因此在臨床研究中應(yīng)考慮到不同種屬之間的區(qū)別。見表3。

表3 鹽酸雷諾嗪與各種屬血漿蛋白的βp及Kdp

3 討論

藥物與血漿蛋白結(jié)合率的研究越來越引起重視，涉及到的測(cè)定方法有平衡透析法、超速離心法和白蛋白微球測(cè)定法等，因?yàn)槠胶馔肝龇ú僮骱?jiǎn)單，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，故本文采用平衡透析法。

試驗(yàn)中對(duì)流動(dòng)相的選用[乙腈-水、甲醇-水、甲醇-水(醋酸-醋酸銨緩沖溶液，pH值4.0)、甲醇-水(醋酸-醋酸銨緩沖溶液，pH值4.5)、甲醇-水(醋酸-醋酸銨緩沖溶液，pH值5.5)]和樣品處理時(shí)的萃取溶劑(石油醚、乙醚和乙酸乙酯)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相中加入醋酸-醋酸銨緩沖溶液(pH值4.5)，不僅可以改善峰形，而且更利于分離，故最終確定流動(dòng)相為甲醇-水(醋酸-醋酸銨緩沖溶液，pH值4.5)。通過比較不同萃取溶劑時(shí)血漿中鹽酸雷諾嗪的提取回收率，發(fā)現(xiàn)乙醚做萃取溶劑時(shí)回收率最高，且萃取后較容易揮干，故最終確定乙醚為提取溶劑。

本文通過建立鹽酸雷諾嗪血漿蛋白結(jié)合率的HPLC測(cè)定方法，計(jì)算不同種屬血漿蛋白的相關(guān)參數(shù)，為鹽酸雷諾嗪的臨床應(yīng)用提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)該藥在國(guó)內(nèi)的應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2014.21.057

063000 河北省唐山市，中國(guó)人民解放軍第255醫(yī)院藥械科(王艷梅、王俊學(xué))；河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院肝膽外科(李秀輕)

R 914.1

A

1002-7386(2014)21-3339-03

2014-05-11)