支嘉健， 唐 薇， 喬 婧， 周月明

(1.畢節(jié)市環(huán)境監(jiān)測中心站， 貴州 畢節(jié) 551700；2.環(huán)境微生物與生態(tài)研究中心，中國科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院， 重慶 400714)

苯(Benzene)、甲苯(Toluene)、乙苯(Ethylbenzene)、二甲苯(Xylene)(合稱為BTEX)等芳香族苯系物是工業(yè)上經(jīng)常使用的有機(jī)溶劑，被廣泛應(yīng)用于油漆、脫脂、干洗、印刷、紡織、合成橡膠等行業(yè)。在BTEX 的生產(chǎn)、儲運(yùn)和使用過程中均會由于揮發(fā)而造成大氣污染。經(jīng)研究，BTEX 具有神經(jīng)毒性(引起神經(jīng)衰弱、頭痛、失眠、眩暈、下肢疲憊等癥狀)和遺傳毒性(破壞DNA)，長期接觸可以導(dǎo)致人體患貧血癥和白血病，因此 BTEX被美國環(huán)保局列為主要環(huán)境污染物[1-2]。

近年來，雖然苯系物的降解菌已有較多報(bào)道，但大部分菌株僅能降解某 1種或 2種苯系化合物，且其降解效率有待進(jìn)一步提高[3]，而對苯、甲苯、乙苯、二甲苯均能實(shí)現(xiàn)高效降解的菌株并不多見。已報(bào)道的降解苯系物的細(xì)菌包括假單胞菌(Pseudomonas)[4-6]、不動桿菌(Acinetobacter)[7]、紅球菌 (Rhodococcus)[8]、羅爾斯通氏菌(Ralstonia)[9]、產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)、黃桿菌(Flavobacterium)、分枝桿菌(Mycobacterium)等[10]，Pseudomonas和相近種屬被報(bào)道能同時降解BTEX[11-12]。陰溝腸桿菌廣泛存在于自然界中，在人和動物的糞便、水、泥土、植物中均可檢出，是腸道正常菌種之一，而假單胞菌(Pseudomonas)是主要存在于水、土壤、空氣中，陰溝腸桿菌比假單胞菌的存在更廣泛，更易獲得，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值更高。經(jīng)檢索相關(guān)文獻(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)陰溝腸桿菌(Enterobactergergoviae)降解 BTEX的相關(guān)報(bào)道。本研究分離篩選出能同時降解BTEX的高效菌株Enterobactergergoviaestrain: NBRC 105706，并對其降解特性和生物學(xué)特性進(jìn)行分析，以期為菌種的實(shí)際應(yīng)用積累一定的理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料及儀器

1.1.1 儀器

氣象色譜 (Agilent GC7890，美國)；頂空進(jìn)樣器(Agilent 7694E，美國)；環(huán)境掃描電子顯微鏡(FEI，美國)；酶標(biāo)儀(bio-tek Epoch，美國)。

1.1.2 培養(yǎng)基

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：Na2HPO4·12H2O 3.8 g/L；KH2PO41.0 g/L；KCl 3.0 g/L；MgSO4·7H2O 0.2 g/L；NH4NO31.13 g/L，pH=7。裝于三角瓶中，121℃高壓滅菌20 min。

微量元素液：FeSO40.3 g/L，CuSO4·5H2O 0.038 g/L，ZnSO4·7H2O 0.115 g/L，MnSO40.169 g/L，H3BO30.116 g/L，CoCl2·6H2O 0.024 g/L，Na2Mo·2H2O 0.017 g/L，pH 7.2～7.4。

選擇性固體培養(yǎng)基：無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入20g瓊脂，滅菌后倒平板，并噴涂BTEX試劑即得。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，H2O 1L；pH 7.2(固體培養(yǎng)基中加瓊脂 20 g)。

1.2 方法

1.2.1 BTEX降解菌的分離篩選

從長壽工業(yè)園區(qū)污水處理廠初沉池，取90 mL污水水樣，加入10 mL LB液體培養(yǎng)基，30 ℃，120 r/min培養(yǎng)24 h。靜置片刻后，取10 mL上清液于1200 r/m條件下離心10 min，將菌體投入盛有100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基的錐形瓶中30 ℃、120 r/min進(jìn)行搖床培養(yǎng)，BTEX初始濃度5 mg/L。BTEX初始質(zhì)量濃度逐步提升，經(jīng)10代培養(yǎng)，BTEX終濃度100 mg/L，取適量培養(yǎng)液稀釋并涂布于選擇性固體平板。待有明顯菌落出現(xiàn)時，從中選擇形態(tài)特征相異的菌落進(jìn)行反復(fù)劃線分離，直至得到純菌株。將所得各菌制備成菌懸液并重新接至無機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩，選取降解率較高的菌株作為優(yōu)勢菌。

1.2.2 菌株生長曲線的測定

取對數(shù)生長期的菌體，1 200 r/min下離心10 min，將菌體用等體積的無機(jī)鹽洗滌兩次，重新懸浮于無機(jī)鹽培養(yǎng)基(OD600=1.0)中，以5% (V/V)的接種量接種于200 mg/L的BTEX無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，2 h取樣1次，測定菌株生物量(OD600)，試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.3 測試方法

頂空進(jìn)樣條件：

加熱爐溫度: 50 ℃; 進(jìn)樣系統(tǒng)溫度: 60 ℃; 傳輸管溫度: 60 ℃; 樣品加熱平衡時間:10 min; 加壓時間:10 s; 取樣時間:10 s; 進(jìn)樣時間: 10 s; 搖晃模式: 輕搖; 載氣壓力: 100 kPa; 輔助氣壓力: 85 kPa。

色譜條件：

色譜柱: Agilent 19091J-413 HP-5 ( 15 m×0.32 mm×0.25 μm); 柱溫: 初溫60℃,保持4 min，以5℃/min升至100℃，保持1min; 進(jìn)樣口溫度: 200℃; FID檢測器溫度: 280℃; 載氣: N2, 流量為1.0 mL/min; H2流量: 40 mL/min; 空氣流量: 400 mL/min; 尾吹氣流量: 30 mL/min; 分流比:10:1。

1.2.4 降解率計(jì)算方法

降解率(%)=(苯系物減少量-苯系物揮發(fā)量)/(苯系物總量-苯系物揮發(fā)量)×100%

1.2.5 菌株生理生化分析及16S r DNA鑒定

菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)方法參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》。

細(xì)菌 DNA提取和純化采用TIANGEN柱離心式環(huán)境樣品試劑盒，從細(xì)菌基因組中對16S rDNA進(jìn)行序列PCR擴(kuò)增，選用細(xì)菌通用引物27F和1492R，引物合成由華大基因工程有限公司完成，PCR產(chǎn)物由華大基因工程有限公司完成測序，然后將測序結(jié)果同GenBank中的基因序列進(jìn)行同源性比較分析，確定種屬。PCR條件如下：

50 μL體系：dNTP 4 μL；10×Buffer 5 μL；Mg2+3 μL；Tag酶 0.25 μL；引物各1 μL；模版 1 μL；補(bǔ)水至50 μL。

PCR程序：95 °C 10 min；95 °C 30 s；55 °C 30 s；72 °C 60 s，30個循環(huán)。

1.2.6 btex-4菌株對苯系物的降解特性

將對數(shù)生長期的菌體離心后重新懸浮于無機(jī)鹽培養(yǎng)基(OD600=1.0)中，以一定的接種量接種于BTEX無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在不同底物濃度(25、50、75、100、150、200 mg/L)、不同溫度(10、20、30℃)、不同pH(pH=5、6、7、8、9)等條件下，接種量5%，150 r/min振蕩培養(yǎng)，以相同條件下未加菌的BTEX無機(jī)鹽培養(yǎng)基為對照。每隔12 h 取樣測定 OD600和殘留的BTEX濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌生理生化分析與菌種鑒定

通過初篩與復(fù)篩，選育到 1株能同時高效降解BTEX的菌株，編號為btex-4，對該菌株進(jìn)行常規(guī)的生理生化實(shí)驗(yàn)，并觀察其菌落形態(tài)特征。掃描電鏡圖如圖 1所示，菌落呈圓形、 濕潤、 表面光滑、 灰白色；桿菌，有周身鞭毛，無芽孢，無莢膜；菌株革蘭氏染色顯陰性；淀粉水解酶陰性、吲哚實(shí)驗(yàn)陰性、明膠實(shí)驗(yàn)陰性，乳糖實(shí)驗(yàn)陽性、葡萄糖實(shí)驗(yàn)陽性、觸酶陽性、氧化酶陰性。細(xì)菌的 16SrDNA序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中注冊的Enterobactergergoviaestrain: NBRC 105706的同源性高達(dá)99%，表明btex-4菌株為一株陰溝腸桿菌。

圖1 菌株 btex-4微觀形態(tài)

2.2 菌株btex-4的生長曲線

在溫度為30℃，底物濃度為200 mg/L，pH 7.0，150 r/min條件下測定btex-4的生長曲線，如圖2所示。

圖2 btex-4的生長曲線

生物量OD600測定結(jié)果如圖2所示，btex-4菌的對數(shù)生長期持續(xù)12 h，12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，OD600達(dá)到最大值，54h后生物量逐漸下降。

2.3 菌株 btex-4對苯系物降解特性

2.3.1 不同初始質(zhì)量濃度下苯系物的降解率

在溫度為30℃，pH 7.0，150 r/min條件下污染物不同起始質(zhì)量濃度的降解特性如圖3所示。

當(dāng)?shù)孜餄舛葹?5 mg/L時，24 h內(nèi)可以將乙苯全部降解，36 h內(nèi)可以將苯、甲苯、二甲苯全部降解，OD600隨著降解速率的增大而增大，24 h達(dá)到最大1.16。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0 mg/L時，可以在48 h內(nèi)將苯、甲苯、乙苯、二甲苯全部降解，OD600在12 h達(dá)到1.08，降解速率較高時，OD600保持在1.15左右，當(dāng)降解速率降低時，OD600開始降低。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?00 mg/L時，48 h對苯、甲苯、乙苯、二甲苯的降解率依次為90.04%、90.26%、92.68%、96.00%。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?50 mg/L時，60 h可以將甲苯、乙苯全部降解，60 h內(nèi)苯的降解率為98.52%，二甲苯的降解率為98.75%。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?00 mg/L時，60 h內(nèi)甲苯和二甲苯可以被全部降解，苯的降解率為87.81%，乙苯的降解率為85.52%。

由圖3還可以看出，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?5 mg/L時，OD600在24 h才達(dá)到1.15，而其他底物濃度在12 h即可達(dá)到1.15左右，這說明底物濃度過低，微生物缺乏碳源，生長緩慢，當(dāng)?shù)孜餄舛壬邥r，菌株生長速率加快。當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?00 mg/L時，乙苯的降解速率降低，可能是底物濃度過高，抑制了乙苯降解過程中相關(guān)酶的活性，導(dǎo)致乙苯的降解速率較低。

(a)底物濃度25mg/L

(b)底物濃度50mg/L

(c)底物濃度100mg/L

(d)底物濃度150mg/L

(e)底物濃度200mg/L圖3 不同質(zhì)量濃度苯系物的降解過程

2.3.2 不同pH下苯系物的降解率

在溫度為30℃，底物濃度為100 mg/L，150 r/min條件下不同pH的降解特性如圖4所示。

培養(yǎng)基的pH值對微生物的生長具有非常明顯的影響，也是影響降解過程中各種酶活性的重要因素。pH還會影響菌體對基質(zhì)的利用速率和細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，引起膜透性發(fā)生變化，從而影響菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和底物的降解。

如圖4所示，當(dāng)pH 5時，btex-4只在12～24 h對底物有一定的降解，OD600在該階段達(dá)到0.21，24 h以后，菌株不再利用底物，OD600維持在0.25～0.22之間，這說明pH 5的酸性條件抑制了菌株的生長，同時抑制了菌株的降解能力。當(dāng)pH 9時，OD600小于0.10，同時底物不能被菌株利用，說明pH 9時btex-4菌株無法生長。當(dāng)pH 6、8時，菌株可以正常生長并在72 h內(nèi)將底物全部降解，pH 7時，菌株長勢最好，OD600在12 h達(dá)到1.20左右，而pH 6、8時，OD600在24 h才達(dá)到1.20左右，這說明中性條件更有利于菌株的生長和酶促反應(yīng)的進(jìn)行，降解速率在中性條件下達(dá)到最大值。

(a)pH 5

(b)pH 6

(c)pH 7

(d)pH 8

(e)pH 9圖4 不同pH下苯系物的降解過程 及培養(yǎng)液OD600變化

2.3.3 不同溫度下苯系物的降解率

底物濃度為100 mg/L，pH 7，150 r/min條件下不同溫度苯系物的降解特性如圖5所示。

溫度變化對菌體的生長和降解速率都有一定的影響。通過圖5可以得到btex-4菌株在48 h內(nèi)對苯系物的降解率如表1所示，在10～30 ℃之間，隨著溫度的升高，降解率隨之升高，菌體達(dá)到對數(shù)生長期所用的時間也越少，這說明較高的溫度有利于菌體的生長和降解反應(yīng)的發(fā)生。但菌株在10～30 ℃之間都可以正常生長并將底物降解，所以該菌可以適應(yīng)10～30 ℃的溫度范圍。

(a)T 10℃

(b)T 20℃

(c)T 30℃圖5 不同溫度下苯系物的降解過程及 培養(yǎng)液OD600變化

表1 不同溫度下48h內(nèi)苯系物的降解率

3 結(jié)論

以長壽工業(yè)園區(qū)污水處理廠初沉池廢水為菌源，通過初篩和復(fù)篩，得到一株以BTEX為唯一碳源的陰溝腸桿菌，命名為btex-4。細(xì)菌的16SrDNA序列分析表明該菌株為Enterobactergergoviaestrain: NBRC 105706。該菌株在生長12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，持續(xù)42 h，培養(yǎng)54 h后進(jìn)入衰亡期。btex-4在溫度為30 ℃，底物濃度為100 mg/L，pH 7.0，150 r/min條件下，48 h內(nèi)對BTEX的降解率依次為90.04%、90.13%、92.68%、95.83%。菌株在pH=6～8的范圍內(nèi)，可以正常生長并在72 h內(nèi)將底物全部降解。同時btex-4可以降解25～200 mg/L的BTEX，當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀?5 mg/L時，菌株生長緩慢，當(dāng)?shù)孜餄舛雀哂?00 mg/L時，會對乙苯的降解產(chǎn)生抑制，乙苯的降解速率降低。另外，該菌株可以適應(yīng)10～30 ℃的溫度變化，且隨著溫度的升高，降解率和降解速率隨之升高。

BTEX的降解菌多為環(huán)境菌株，例如假單胞菌、不動桿菌、紅球菌、產(chǎn)堿桿菌等，BTEX的好氧降解途徑也是在以上菌株的作用下得到的，而本文研究的菌株btex-4為典型的腸桿菌，后續(xù)研究可以集中在菌株btex-4對BTEX的降解途徑等方面，探索BTEX好氧降解的新途徑。

參 考 文 獻(xiàn)

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