★ 張岳 李養(yǎng)學(xué) 程青云 孫冬梅

(1.廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校 廣東 廣州 510663；2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院 廣東 廣州 510095)

調(diào)血養(yǎng)發(fā)洗劑源于廣東省第二中醫(yī)院的臨床經(jīng)驗方，由白芷、黃柏、干姜、側(cè)柏葉等中藥制備而成，具有清熱解毒、燥濕止癢、益發(fā)生發(fā)的功效。臨床主治脂溢性脫發(fā)，對頭皮發(fā)癢，頭屑多等有顯著療效。為了有效控制本產(chǎn)品的質(zhì)量，保證用藥的安全和療效，本文采用HPLC法對君藥白芷中歐前胡素進(jìn)行了含量測定，為補充和完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及開發(fā)成臨床新藥奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695-2498高效液相色譜儀(美國Waters公司)、Mettler-Toledo XS205DU電子分析天平(瑞士)、MilliPore Advantage A10超純水機(美國)、HWS-26電熱恒溫水浴鍋(上海)、DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏設(shè)備有限公司)、KQ52300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 歐前胡素對照品(110826-201013，含量以99.6%計算)、購于中國藥品生物制品檢定院；調(diào)血養(yǎng)發(fā)洗劑(批號：20120401、20120402、20120403)由廣東省第二中醫(yī)院制劑室提供；乙腈、甲醇為色譜純試劑(一級)；水為超純水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：乙腈-水(48∶52)[1]；檢測波長為254nm；流速：1.0mL/min；柱溫：25℃。在上述色譜條件下，歐前胡素與其他成分能較好分離，陰性對照溶液在歐前胡素對照品相同保留時間位置上未見色譜峰，說明陰性對照無干擾，見圖1～3。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取歐前胡素對照品12.30mg，置50mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取10mL，置于100mL量瓶中，加甲醇至刻度，即制得每1mL含歐前胡素24.5016μg的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品約4mL，精密稱定，置蒸發(fā)皿中，加硅藻土適量吸附，蒸干，轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中，加甲醇45mL，超聲處理(功率300W，頻率50kHz)1小時，取出，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，過0.45μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

圖1 歐前胡素對照品HPLC圖譜

圖2 供試品HPLC圖譜

圖3 陰性對照HPLC圖譜

2.4 陰性對照溶液的制備 取按調(diào)血養(yǎng)發(fā)洗劑制備工藝制備的缺白芷的陰性樣品4mL，按“2.3”項下供試品溶液制備方法制成白芷陰性對照溶液。

2.5 線性范圍的考察 精密量取“2.2”項下配制好的對照品溶液1,2,3,4,5mL，分別置5mL量瓶中，加入甲醇并稀釋至刻度，得歐前胡素的濃度分別為4.90032，9.80064，14.70096，19.60128，24.50160μg的對照品溶液。精密吸取上述溶液各10μL，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，測定峰面積。以峰面積(Y)對歐前胡素含量(X)進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=4239.8X-9114.5(r=0.9999)。歐前胡素在49.0032～245.0160 ng范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液(10μg/mL)10μL連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測得峰面積積分值RSD<2%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品(批號：20130401)溶液，分別于0，2，4，8，12 h進(jìn)樣10μL，測得樣品中歐前胡素峰面積值的RSD<2%(n=5)，表明供試品溶液12小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重現(xiàn)性試驗 取同一批樣品(批號：20130401)按“2.3”項下方法制備供試品溶液6份，按擬定的含量測定方法，分別精密吸取10μL進(jìn)樣，測得峰面積積分值并計算含量，得歐前胡素含量RSD<2%(n=6)，表明本方法重現(xiàn)性較好。

2.9 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品溶液(批號20130401)9份，每份精密量取2mL，分別精密加入“2.2”項下的歐前胡素對照品1，1.3，1.5mL(80%，100%，120%)三種不同濃度的母液，按“2.3”項下方法處理，并按“2.1”項下色譜條件測定，計算平均回收率為99.30%，RSD為1.42%(n=9)，表明本含量測定方法準(zhǔn)確度高，方法可靠，結(jié)果見表1。

表1 歐前胡素加樣回收率測定結(jié)果(n=9)

2.10 樣品測定 取不同批次樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果(n=2，mg·mL-1)

3 討論

白芷為本制劑的君藥，歐前胡素為白芷的主要有效成分，故選擇歐前胡素作為控制本品質(zhì)量的指標(biāo)成分。含白芷的中藥復(fù)方制劑中歐前胡素的含量測定方法，文獻(xiàn)報道有薄層色譜法和高效液相色譜法等[2,3]。試驗中曾參照《中國藥典》2010年版一部白芷的含量測定方法，結(jié)果歐前胡素色譜峰分離度較差，有包峰出現(xiàn)，嘗試改變流動相的比例，但出峰太慢，分析時間較長，且分離度改善不大。通過查閱文獻(xiàn)，改變流動相，實現(xiàn)了歐前胡素色譜峰與其它成分色譜峰的良好分離，且保留時間適中，出峰時間較早，峰形對稱。另外，試驗中對不同色譜柱，流速以及柱溫等因素進(jìn)行了考察，最終確定以本文所述方法測定調(diào)血養(yǎng)發(fā)洗劑中歐前胡素的含量。方法學(xué)考察結(jié)果表明，該方法簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于本品的質(zhì)量控制，為今后開發(fā)成臨床新藥奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。

[1]鄭立紅,李衛(wèi)敏,陳志峰.不同產(chǎn)地白芷中歐前胡素的含量測定[J].世界中醫(yī)藥,2012,7(1):79-80.

[2]李海燕,岑志芳,林玉明.中藥新藥復(fù)方天麻頭風(fēng)膠囊中白芷的含量測定研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2006,17(6):965-966.

[3]姜雪,王萍,王洋,等.興安白芷種子歐前胡素含量的HPLC分析及不同產(chǎn)地的含量測定[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2008,28(3):101-103.